Cualquiera que trabaje en diagnóstico molecular probablemente se haya encontrado con estos escenarios: − Los estándares funcionan perfectamente, pero cambiar a tierra, heces, sangre entera, plantas o extractos de alimentos hace que el valor de Cq se retrase repentinamente. − Aparecen curvas de amplificación, pero con fluorescencia débil; sin embargo, aparecen bandas diana claras en un gel de agarosa. − La cuantificación general de qPCR está subestimada y los resultados siguen siendo inestables incluso con una curva estándar. − Cambiar a dPCR bajo la creencia de que "la PCR digital es inmune a la inhibición" aún da como resultado particiones/gotas apagadas y números absolutos de copias subestimados.

Detrás de estos problemas, los inhibidores de la PCR suelen desempeñar un papel central. Una reseña publicada enQuímica Analítica y Bioanalíticadescribe sistemáticamente los mecanismos de inhibición en qPCR, dPCR y MPS: La PCR es mucho más compleja que simplemente mezclar una plantilla con una mezcla maestra. Se basa simultáneamente en la polimerización del ADN in vitro, la hibridación de cebadores, la desnaturalización/renaturalización y la detección de fluorescencia. Si ciertas moléculas de la matriz interfieren con cualquiera de estos pasos, los resultados se distorsionarán.

La revisión ilustra las subreacciones críticas de la PCR como una cadena continua:Desnaturalización de plantilla → Unión de cebador-una sola hebra → Extensión de polimerasa → Acumulación de producto → Detección de fluorescencia.

Un inhibidor de la PCR generalmente se refiere a cualquier sustancia que se origina en la matriz de la muestra, las células diana o los reactivos de extracción que interfiere con la polimerización in vitro o la señalización de fluorescencia.

Los puntos comunes de interferencia se dividen en tres categorías principales:

1. Apuntando directamente a la polimerasaLos inhibidores reducen la actividad de Taq u otras ADN polimerasas termoestables, lo que reduce la eficiencia general de la amplificación. Cuando los ciclos tempranos se ven afectados, la Cq se retrasa; cuando se ve afectada en su totalidad, la amplificación puede fallar por completo. El ácido húmico, la hemoglobina, la hemina, las sales biliares, el ácido fítico y los polifenoles son compuestos típicos que alteran la actividad de la polimerasa.

2. Interferir con ácidos nucleicos/recocido de imprimadoresLos inhibidores se unen al ADN monocatenario (ssDNA) o bicatenario (dsDNA), impidiendo que los cebadores accedan a la plantilla. Esto afecta particularmente a los ciclos iniciales. La inmunoglobulina G (IgG) es un ejemplo clásico: se une al ADNss genómico e interrumpe la hibridación del cebador, lo que provoca un retraso en los valores de Cq.

3. Interrumpiendo la detección de fluorescenciaEs posible que estas sustancias no necesariamente causen fallas en la amplificación, pero hacen que el instrumento "no pueda ver" la señal. El ácido húmico y la hemoglobina pueden formar complejos de extinción estática con tintes libres, suprimiendo las señales de SYBR Green I, EvaGreen, ResoLight, ROX y otros. La DTT puede apagar los colorantes pasivos de referencia en ciertos sistemas. Este modo de inhibición es muy engañoso: en realidad se produce la amplificación (las bandas son visibles en la electroforesis en gel), pero la curva de qPCR muestra un inicio retrasado y una meseta reducida; En dPCR, las señales de referencia pasivas suprimidas conducen a configuraciones de umbral positivas/negativas incorrectas.

Figura 1.Representación esquemática de los pasos de reacción clave en PCR. Los inhibidores de la PCR pueden afectar cualquiera de estos pasos, por ejemplo, interfiriendo con el hibridación de cebadores, afectando la actividad de la ADN polimerasa o perjudicando la detección de fluorescencia.

La qPCR se basa en valores de Cq (ciclo de cuantificación) y curvas estándar para la cuantificación absoluta o relativa. En consecuencia, la interferencia de los inhibidores con la cinética de amplificación temprana puede ser fatal para la precisión de los datos.

1. Distorsión de eficiencia:En presencia de inhibidores como el ácido húmico del suelo o las sales biliares fecales, la pendiente de la curva de amplificación cambia, lo que hace que la eficiencia calculada quede fuera del rango aceptable de 90% a 110%. Esto conduce a una cuantificación excesiva o insuficiente.

2. Artefactos de fluorescencia:Si las curvas de amplificación no aumentan adecuadamente pero la electroforesis en gel de agarosa revela productos objetivo claros, es probable que se produzca una extinción de la fluorescencia. Particularmente con tintes como SYBR Green, el ácido húmico no solo inhibe las polimerasas sino que también suprime significativamente la intensidad de la fluorescencia.

3. Rescate mediante controles de amplificación internos (IAC):Introducir un IAC en el sistema qPCR es una estrategia eficaz para detectar la inhibición. Si tanto el IAC como la señal objetivo se retrasan simultáneamente, se confirma la presencia de inhibidores de la matriz en lugar de un problema con la secuencia objetivo en sí.

Figura 2.Ejemplos de inhibición de PCR en qPCR.a.Curvas de amplificación obtenidas con cantidades crecientes de ácido fúlvico, que inhibe la amplificación.b.Electroforesis en gel de agarosa correspondiente a las reacciones de amplificación ena.do.Curvas de amplificación obtenidas con cantidades crecientes de ácido húmico, que apaga la fluorescencia.d.Electroforesis en gel de agarosa correspondiente a las reacciones de amplificación endo. Los números en las figuras representan la cantidad de ácido húmico o fúlvico añadido a la mezcla de reacción. PC (control positivo) indica una reacción en la que el inhibidor de la PCR se reemplazó con agua. La detección se realizó utilizando colorante EvaGreen.

Al dividir la mezcla de reacción en decenas de miles de gotas o microcámaras para la lectura del punto final, la dPCR no depende de los valores de Cq. Como resultado, su tolerancia a una inhibición leve es superior a la qPCR. Sin embargo, la revisión enfatiza explícitamente que la dPCR no es una cura universal.

1. Límites de dilución de partición:Si bien la partición reduce la concentración de inhibidor dentro de los microcompartimentos individuales, una inhibición fuerte aún puede causar fallas en la amplificación en algunas gotas, lo que lleva a una disminución de la tasa positiva y a una subestimación del número absoluto de copias.

2. Diferencias sustanciales entre polimerasas:Las polimerasas varían dramáticamente en su tolerancia a los inhibidores. La revisión señala que cambiar a polimerasas específicas tolerantes a inhibidores o tampones optimizados puede aumentar diez veces la tolerancia de la dPCR al ácido húmico.

3. Supresión de señales de referencia pasivas:La dPCR se basa en umbrales de fluorescencia para distinguir las particiones positivas de las negativas. Si la hemoglobina o el ácido húmico en la muestra apaga los colorantes de referencia pasivos como ROX, la normalización del umbral falla, lo que genera falsos negativos donde los positivos débiles se clasifican erróneamente.

• Ambiental Suelo / Agua:Ácido húmico, ácido fúlvico. Actúan a través de mecanismos duales, inhibiendo las polimerasas y apagando la fluorescencia de SYBR/EvaGreen.

• Sangre / Plasma:Hemoglobina, hemina, IgG. La hemoglobina envenena directamente las polimerasas y apaga los colorantes, mientras que la IgG actúa como un "pegamento" que se une al ADN y bloquea el recocido de los cebadores.

• Heces/Muestras Intestinales:Sales biliares, ácido fítico, polisacáridos. Principalmente inhiben la actividad de la polimerasa, lo que resulta en una baja eficiencia de amplificación.

• Plantas/Materiales Alimenticios:Polifenoles, taninos, polisacáridos, pigmentos. Los polifenoles se unen a las proteínas tras la oxidación, mientras que los polisacáridos aumentan la viscosidad y coprecipitan con el ADN.

Cuando se trata de inhibidores, la dilución en serie tradicional a menudo pierde valiosos patrones objetivo de baja abundancia. Se recomienda una combinación de las siguientes estrategias prácticas:

1. Cambio de polimerasas como medida principal:No se centre únicamente en las enzimas de "alta fidelidad"; priorizartolerante a inhibidorespolimerasas. Elija enzimas tolerantes a la sangre para muestras de sangre y enzimas tolerantes a los ácidos húmicos para muestras de suelo ambiental.

2. Uso Estratégico de Aditivos:

   • BSA (albúmina sérica bovina):Se une eficazmente a ciertas sustancias inhibidoras para rescatar las polimerasas afectadas, aunque no resuelve la extinción del tinte.

   • T4 gp32 / Agentes de eliminación de húmicos:Se pueden utilizar aditivos especializados para la eliminación de inhibidores para matrices ambientales complejas.

3. Ajuste de los métodos de detección:Si SYBR Green se apaga constantemente, considere cambiar a sondas de hidrólisis (por ejemplo, TaqMan), que generalmente son menos susceptibles a la interferencia de la fluorescencia de la matriz.

4. Acortamiento de la longitud del amplicón:En sistemas dPCR y qPCR inhibidos, mantenga las longitudes de los amplicones dentro de70-120 pb. Los fragmentos más cortos se amplifican con una eficiencia significativamente mayor en condiciones adversas en comparación con objetivos más largos.