El analizador de interacción FCS ayuda al equipo de la Universidad de Medicina de Fujian a descubrir un fármaco para el Alzheimer de moléculas pequeñas

Diario: Investigación farmacológica

Equipo de investigación:Equipo Xiaochun Chen / Feisheng Zhong / Zucheng Ye, Universidad Médica de Fujian

DOI:https://doi.org/10.1016/j.phrs.2025.107834

01 Descripción general de la investigación

La galectina-3 (Gal-3) es una proteína clave que regula los procesos neuroinflamatorios y desempeña un papel crucial en la progresión patológica de la enfermedad de Alzheimer (EA), lo que la convierte en una diana terapéutica muy prometedora. Sin embargo, el desarrollo de inhibidores de moléculas pequeñas que puedan inhibir eficientemente la actividad de Gal-3 y al mismo tiempo posean una fuerte permeabilidad de la barrera hematoencefálica sigue siendo un desafío importante en este campo.

El equipo de investigación dirigido por Xiaochun Chen, Feisheng Zhong y Zucheng Ye de la Universidad Médica de Fujian publicó un estudio titulado"Descubrimiento impulsado por IA de inhibidores de Galectina-3 penetrantes en el cerebro para la terapia de la enfermedad de Alzheimer"en la revista autorizada de farmacologíaInvestigación farmacológica(SI = 10,5). Utilizando una plataforma de detección de fármacos asistida por IA, el estudio identificó con éxito FJMU1887, un compuesto de molécula pequeña con valor terapéutico potencial, y verificó su interacción de unión directa con Gal-3 mediante experimentos posteriores. Los estudios mecanicistas demostraron que FJMU1887 se une reversiblemente a Gal-3, interfiriendo con la interacción entre Gal-3 y TREM2 (receptor desencadenante expresado en células mieloides 2). Másin vitroensayos antiinflamatorios, análisis farmacocinéticos yen vivoLas evaluaciones de eficacia demostraron colectivamente que FJMU1887 es un inhibidor de Gal-3 de molécula pequeña permeable a la BBB con efectos duales: inhibir la neuroinflamación y mejorar la función cognitiva. En general, FJMU1887 representa el primer inhibidor oral de Gal-3 con una permeabilidad cerebral favorable que exhibe efectos antineuroinflamatorios y de mejora cognitiva, lo que proporciona un compuesto líder prometedor para la terapia de la EA y al mismo tiempo valida la viabilidad de las estrategias de descubrimiento de fármacos asistidas por IA.

02 Investigación de los efectos de las moléculas pequeñas en la dinámica de los complejos proteicos mediante FCS

TREM2 es un receptor específico de microglia implicado en la modulación de las respuestas neuroinflamatorias y la fagocitosis microglial en la EA. Estudios recientes han demostrado que Gal-3 interactúa con TREM2, influyendo así en los estados de activación microglial y las vías de señalización inflamatorias asociadas.

En este estudio, los autores confirmaron por primera vez la actividad de unión de FJMU1887 a Gal-3 utilizando métodos de ensayo de interacción convencionales, incluida la interferometría de biocapa (BLI) y la termoforesis a microescala (MST), obteniendo una constante de disociación (kd) de1,55μM. Para explorar más a fondo el impacto específico de FJMU1887 en las interacciones de proteínas mediadas por Gal-3, el equipo empleó espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) para monitorear la formación dinámica y la disociación del complejo Gal-3/TREM2.in situdentro de las células vivas.

En la configuración experimental, Gal-3 y TREM2 etiquetados con las proteínas fluorescentes moxCerulean3 y mGold, respectivamente, se cotransfectaron en células HEK293. Después de la obtención de imágenes confocales, la FCS se realizó en regiones de colocalización de fluorescencia para medir el coeficiente de difusión (D) de TREM2-mGold, monitoreando continuamente los cambios dinámicos durante el tratamiento y el lavado del compuesto (Figura A). Los resultados mostraron que FJMU1887 interrumpió la interacción entre Gal-3 y TREM2 soluble (sTREM2), lo que llevó a un aumento significativo en el coeficiente de difusión intracelular de sTREM2. Tras eliminar el compuesto, Gal-3 se volvió a unir a sTREM2 y el coeficiente de difusión volvió al valor inicial. Esto indicó que la unión reversible de FJMU1887 a Gal-3 modula dinámicamente la interacción Gal-3/TREM2. Esta conclusión fue validada aún más por experimentos de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), que proporcionaron evidencia complementaria de que FJMU1887 afecta la formación o estabilidad del complejo Gal-3/TREM2. El equilibrio dinámico de este complejo juega un papel importante en la regulación de la neuroinflamación asociada a la EA.

Cifra.Interrupción de la formación del complejo Gal-3/TREM2 por FJMU1887 evaluada mediante FCS. El coeficiente de difusión (D) del complejo Gal-3-TREM2 se midió en diferentes condiciones. Tratamiento con10μMFJMU1887 aumentó significativamente el coeficiente de difusión en comparación con el complejo no tratado (***P < 0,001), lo que indica una alteración compleja. En particular, el efecto de FJMU1887 fue reversible: después del lavado, el coeficiente de difusión se recuperó en gran medida a los niveles iniciales, lo que demuestra una reformación compleja. Los puntos de datos individuales representan mediciones únicas; las barras indican la media ±SEM. La significación estadística se determinó mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba post-hoc de Tukey.

03 Ventajas tecnológicas clave de FCS

FCS no sólo capturó con éxito la alteración de la dinámica del complejo proteico por parte del fármaco, sino que también reveló claramente la cadena completa del mecanismo:encuadernación reversible→disociación compleja → inhibición funcional. Esto resalta el valor único de FCS en el estudio de las interacciones proteína-proteína de células vivas y los mecanismos reguladores de moléculas pequeñas.in situ:

• Monitoreo dinámico en tiempo real:Supervisa procesos en microambientes celulares nativos sin requerir umbrales de distancia intermolecular fijos. Cualquier cambio en el radio hidrodinámico o la conformación resultante de la unión se puede detectar mediante cambios en el coeficiente de difusión.

• Detección de equilibrio in situ:Mide directamente en condiciones de equilibrio de unión-disociación en solución o células vivas sin pasos de lavado, alcanzando sensibilidad de una sola molécula.

• Análisis cinético cuantitativo:Genera coeficientes de difusión como métricas cuantitativas continuas, a diferencia de los ensayos cualitativos o de criterio de valoración convencionales. Combinado con experimentos de lavado, demuestra directamente la reversibilidad de la inhibición de compuestos, proporcionando datos cuantitativos para evaluaciones mecanicistas y de eficacia.

Gracias a estas ventajas, FCS logró la observación dinámica en tiempo real de la inhibición reversible de FJMU1887 de la interacción Gal-3/TREM2, una dimensión de difícil acceso mediante técnicas bioquímicas tradicionales.

04 Importancia de la investigación y perspectivas futuras del FCS

Este estudio aprovechó con éxito la detección de fármacos asistida por IA para identificar el compuesto principal FJMU1887 de una gran biblioteca química. Al combinar múltiples técnicas ortogonales (análisis de afinidad (BLI/MST), medición de distancia intermolecular (FRET) y monitoreo dinámico de interacción de proteínas (FCS), el equipo decodificó sistemáticamente el mecanismo de acción desde múltiples perspectivas. Extensoin vitroyen vivoLas evaluaciones confirmaron que FJMU1887 posee actividades duales antineuroinflamatorias y de mejora cognitiva, estableciendo su potencial como candidato terapéutico para la EA.

En esta plataforma integrada, FCS proporcionó datos críticos de difusión dinámica de células vivas que no se pueden obtener con otros métodos, lo que demuestra que FJMU1887 interrumpe de forma reversible la unión de Gal-3/TREM2. Esto ofreció evidencia directa para dilucidar el mecanismo del fármaco y proporcionó una validación adicional de la interacción directa entre Gal-3 y TREM2. El estudio muestra las principales ventajas de FCS: monitoreo en tiempo real de dinámicas complejas en solución, medición sin máscara y sin ataduras y salida cuantitativa directa de coeficientes de difusión.

Acerca de la tecnología FCS

La espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) mide cuantitativamente parámetros como la concentración molar, el brillo/estado de agregación de la fluorescencia, el coeficiente de difusión/radio hidrodinámico y la afinidad de unión (kd) con resolución de una sola molécula en muestras de solución de microvolumen (unos pocos microlitros) o células vivas individuales. Compatible con muestras fisiológicas (p. ej., lisados ​​celulares, sangre), es unin situHerramienta analítica, homogénea y de alto contenido. FCS y sus métodos derivados se han aplicado ampliamente en transducción de señales, separación de fases líquido-líquido, agregación biomolecular, mecanismos estructurales-funcionales, desarrollo de nanomedicina, caracterización de exosomas, desarrollo de sondas fluorescentes, detección de anticuerpos/fármacos y microfluidos, con más de 15.000 artículos de investigación indexados en PubMed.

Acerca del analizador de interacción JLM-Lifetech FCS

ElAnalizador de interacción molecular FCS serie MIA para cinética de molécula únicaes una plataforma de análisis de alta sensibilidad basada en tecnología FCS. Al detectar señales de fluctuación de fluorescencia en volúmenes de observación extremadamente pequeños, permite el análisis de caracterización e interacción biomolecular de una sola molécula. Utilizando algoritmos de correlación para analizar señales en el dominio del tiempo, el sistema funciona sin pasos de separación o purificación (ensayo homogéneo). Con solo decenas de microlitros de muestra, ofrece un análisis cuantitativo de alto rendimiento de concentración, tamaño de partícula, coeficiente de difusión y afinidad de unión (kd) en segundos.