− 標準は完璧に機能しますが,土壌,糞便,全血,植物,Cq の値が突然遅れる. − 増幅曲線が現れ,しかし弱体フルオレッセンスを有し,アガロースゲルには明確な標的帯が現れる. − 全体的なqPCR定量化が過小評価されている.標準曲線でも結果が不安定です− "デジタルPCRは阻害に抵抗力がある"という信念のもとで dPCRに切り替えた場合,まだ不明な隔壁/滴滴と絶対コピー数が過小評価されます.

これらの問題の背後には,PCR阻害剤がしばしば中心的な役割を果たしています.解析化学と生物分析化学QPCR,dPCR,MPSの抑制メカニズムを体系的に概説しています. PCRは単にテンプレートとマスターミックスを混ぜるよりもはるかに複雑です.実験室でのDNAポリマー化も使っていますプリマーの焼却,デナチュレーション/リナチュレーション,および熒光検出.マトリックス内の特定の分子がこのステップのいずれかに干渉した場合,結果は歪められます.

このレビューでは,PCRの重要なサブ反応を連続鎖として示しています.テンプレートデナチュレーション → プライマーの単鎖結合 → ポリメラーゼ拡張 → 製品蓄積 → 熒光検出.

PCR阻害剤は,一般的に,サンプルマトリックス,標的細胞,または抽出試料から発生し,インビトロポリメリゼーションまたは熒光シグナリングを妨害する物質を指します.

干渉の共通点は 3つの主要カテゴリーに分かれます

1. ポリメラーゼを直接標的とする抑制剤は Taq や他の熱安定性 DNA ポリメラゼの活性を低下させ,全体的な増幅効率を低下させます. 初期サイクルの影響を受けると,Cq が遅れます.増幅が完全に失敗する可能性がありますヒウム酸,ヘモグロビン,ヘミン,胆塩,フィティック酸,ポリフェノールは,ポリメラーゼ活性を低下させる典型的な化合物です.

2. 核酸を干渉する/プライマーの焼却阻害剤は単鎖DNA (ssDNA) または双鎖DNA (dsDNA) に結合し,プライマーのテンプレートへのアクセスを防止する.これは特に初期サイクルに影響を与える.免疫球蛋白G (IgG) は 典型的な例です: ゲノムSSDNAに結合し,プライマーの焼却を妨害し,Cq値が遅くなる.

3. 流光検出を妨げるこれらの物質は必ずしも増幅障害を引き起こすわけではありませんが 装置が信号を"見ることができない"ようにしますヒウム酸とヘモグロビンは,自由染料で静的消化複合体を形成することができる.DTTは,SYBR Green I,EvaGreen,ResoLight,ROXなどからの信号を抑制する.DTTは,特定のシステムで受動参照染料を消すことができる.この抑制モードは非常に欺瞞的である:増幅が実際に起こります (ゲル電解で帯が見えます)dPCRでは,抑制された受動参照信号は,誤った正/陰値設定につながります.

図1PCRにおける主要な反応段階の図表.PCR阻害剤は,例えばプライマーの焼却を妨害し,DNAポリメラーゼ活性に影響を与えることで,これらの段階のいずれかに影響を与える.発光感を損なう.

qPCRは,絶対または相対的な定量化のためにCq値 (定量化サイクル) と標準曲線に依存します.したがって,初期増幅運動学に対する阻害剤による干渉は,データの正確性にとって致命的かもしれない..

1. 効率の歪み増幅曲線の傾きが変化します 増幅曲線の傾きが変化します計算された効率が90%~110%の許容範囲を超えてしまうこれは過度または過小量化につながります.

2. 発光器具増幅曲線が正しく上昇できない場合でも,アガロースゲル電球化により明確な標的製品が明らかになる場合,発光消化が起こる可能性があります.特にSYBRグリーンのような染料で,ヒューミック酸はポリメラゼを抑制するだけでなく,フルオレッセンスの強度を大幅に抑制します.

3. 内部増幅制御 (IAC) による救出:QPCRシステムに IAC を導入することは 抑制を検出するための効果的な戦略です.標的配列自体の問題ではなく,マトリックス阻害剤の存在を確認します.

図2qPCRにおけるPCR抑制の例a.増幅を阻害するフルビック酸の量を増やすことで得られる増幅曲線.(b)アガロースゲル電球解離は,a は.(c)フルオレッセンスを消すヒューミック酸の量を増やすことで得られた増幅曲線.d.アガロースゲル電球解離は,c図の数字は,反応混合物に添加されたヒウム酸またはフルブ酸の量を表します. PC (ポジティブコントロール) は,PCR阻害剤を水で置き換えた反応を示します.EvaGreen染料を用いて検出しました.

反応混合物を数万の滴や微小室に分割して,端点読み取りを行うことで,dPCRはCq値に依存しません.結果として,軽度の抑制に対する耐性は qPCR より優れているしかし,このレビューは,dPCRが普遍的な治療法ではないことを明示的に強調しています.

1. 分割稀释限界:分割によって個々のマイクロコンパートメント内の阻害剤濃度が低下しますが,強い阻害は依然としていくつかの滴滴で増幅障害を引き起こす可能性があります.陽性率が低下し,絶対コピー数が過小評価される.

2. ポリメラゼ の 中 に ある 重要 な 違い:ポリメラゼは 抑制剤に対する耐性が劇的に異なります特定の阻害剤耐性ポリマーゼまたは最適化されたバッファに切り替えることで,ヒューミック酸に対するdPCR耐性が数倍増加することが見込まれています..

3. 消極的な参照信号の抑制:dPCRは,プラスの隔壁と負の隔壁を区別するために,フラウレセンスの限界値に依存します. 標本中のヘモグロビンやヒウム酸が,ROXのような受動性基準染料を消す場合,限界標準化失敗弱いポジティブが誤って分類される場合 偽陰性になります

• 環境 土壌/水:ヒューミック酸,フルビック酸 両方ともポリメラゼを抑制し,SYBR/EvaGreenの熒光を消すという2つのメカニズムによって作用する.

• 血/プラズマ:ヘモグロビン,ヘミン,IgG ヘモグロビン は 直接 ポリメラゼ を 毒し,染料 を 消し去りますが,IgG は DNA に 結合 し,プライマーの 焼却 を 阻害 する "粘着物" の よう に 作用 し ます.

• 糞便/腸内サンプル:胆汁,フィティック酸,ポリサカリドは 主にポリマレーズの活性を抑制し

• 植物/食品材料:ポリフェノール,タンニン,ポリサカリド,ピグメント.ポリフェノールは酸化時にタンパク質に結合し,ポリサカリドは粘度を増やし,DNAと共降水します.

抑制剤を扱うとき,従来のシリアル稀释はしばしば貴重な低濃度標的テンプレートを失います.以下の実践的な戦略の組み合わせが推奨されます.

1. ポリメラゼを交換する 主要な対策:"高信頼性" の 酵素 に 専念 し て は なく,優先 事項 を 設定 する抑制剤耐性血液サンプルには血耐性酵素,環境土壌サンプルにはヒュム酸耐性酵素を選択する.

2. 添加物の戦略的使用

   • BSA (牛血清アルブミン):影響を受けたポリメラゼを救うために特定の抑制物質に効果的に結合しますが,染料消化を解決しません.

   • T4 gp32 / ヒューム除去剤:特殊な抑制剤除去添加物は,複雑な環境マトリックスに使用することができる.

3. 検出方法の調整:SYBR Greenが一貫して消火されている場合,マトリックス・フッ化干渉に一般的に弱い水解探査機 (例えばTaqMan) に切り替えることを検討する.

4. アムプリカンの長さを短くする:dPCR と qPCR 抑制システムでは,アンプリカンの長さを70×120bp短い断片は,より長い標的と比較して,不利な条件下で,より効率的に増幅します.