Jeder, der in der molekularen Diagnostik arbeitet, hat wahrscheinlich auf folgende Szenarien gestoßen:oder Nahrungsextrakte verursacht einen plötzlichen Verzögerung des Cq-Wertes. − Amplifikationskurven erscheinen, jedoch mit schwacher Fluoreszenz, doch auf einem Agarosegel erscheinen klare Zielbänder.und die Ergebnisse bleiben auch bei einer Standardkurve instabil. − Die Umstellung auf die dPCR unter der Annahme, dass "die digitale PCR immun gegen Hemmungen ist", führt immer noch zu unbeleuchteten Trennwänden/Tropfen und einer unterschätzten absoluten Kopienzahl.

In einem Bericht, der in der Zeitschrift "Psychological Research" veröffentlicht wurde, wird dieAnalytische und bioanalytische ChemieDie PCR ist viel komplexer als das einfache Mischen einer Vorlage mit einem Mastermix.Es setzt gleichzeitig auf die in vitro DNA-PolymerisationWenn bestimmte Moleküle in der Matrix einen dieser Schritte beeinträchtigen, werden die Ergebnisse verzerrt.

Die Überprüfung zeigt die kritischen Nebenreaktionen der PCR als kontinuierliche Kette:Vorlage-Denaturierung → Einstrangbindung → Polymerase-Erweiterung → Produktakkumulation → Fluoreszenzdetektion.

Ein PCR-Hemmer bezieht sich im Allgemeinen auf jede Substanz, die aus der Probenmatrix, Zielzellen oder Extraktionsreagenzien stammt und die In-vitro-Polymerisation oder Fluoreszenzsignalisierung beeinträchtigt.

Gemeinsame Störpunkte werden in drei Hauptkategorien eingeteilt:

1. Direkt auf die Polymerase abzielenDie Inhibitoren reduzieren die Aktivität von Taq oder anderen thermostabilen DNA-Polymerasen und senken so die allgemeine Amplifikationseffizienz.Die Verstärkung kann vollständig versagen.Huminsäure, Hämoglobin, Hämin, Gallensalze, Phytsäure und Polyphenole sind typische Verbindungen, die die Polymeraseaktivität beeinträchtigen.

2. Störung von Nukleinsäuren / GrundierungDie Inhibitoren binden sich an die einzelsträngige (ssDNA) oder doppelsträngige DNA (dsDNA), wodurch der Zugang zu den Primaren verhindert wird.Immunoglobulin G (IgG) ist ein klassisches Beispiel: es bindet an die genomische ssDNA und stört die Grundierung, was zu verzögerten Cq-Werten führt.

3. Störung der FluoreszenzdetektionDiese Stoffe verursachen zwar nicht unbedingt Verstärkungsfehler, aber sie machen das Instrument "unfähig", das Signal zu sehen.Huminsäure und Hämoglobin können mit freien Farbstoffen statische Löschkomplexe bilden, die Signale von SYBR Green I, EvaGreen, ResoLight, ROX und anderen unterdrücken.die Verstärkung tatsächlich auftritt (Bänder sind bei Gelelektrophoresis sichtbar), zeigt jedoch die qPCR-Kurve einen verzögerten Beginn und ein reduziertes Plateau; bei dPCR führen unterdrückte passive Referenzsignale zu falschen positiven/negativen Schwellenwerteinstellungen.

Abbildung 1.Schematische Darstellung der wichtigsten Reaktionsschritte in der PCR. PCR-Hemmer können einen dieser Schritte beeinflussen, indem sie beispielsweise die Grundierungsschmelze beeinträchtigen, die DNA-Polymerase-Aktivität beeinträchtigen,oder eine Beeinträchtigung der Fluoreszenzdetektion.

qPCR stützt sich für die absolute oder relative Quantifizierung auf Cq-Werte (Quantifizierungszyklus) und Standardkurven.Interferenzen mit der frühen Amplifikationskinetik durch Inhibitoren können für die Datengenauigkeit tödlich sein..

1. Effizienzverzerrung:In Anwesenheit von Inhibitoren wie Huminsäure aus dem Boden oder Fäkalgalsalzen ändert sich die Steigung der Verstärkungskurve.der berechnete Wirkungsgrad außerhalb des zulässigen Bereichs von 90% ∼110% liegtDies führt entweder zu einer Über- oder Unterquantifizierung.

2. Fluoreszenzartikel:Wenn die Verstärkungskurven nicht richtig ansteigen, aber die Agarose-Gel-Elektrophorese eindeutige Zielprodukte zeigt, tritt wahrscheinlich eine Fluoreszenzlöschung auf.Huminsäure hemmt nicht nur Polymerasen, sondern unterdrückt auch die Fluoreszenzintensivität erheblich.

3. Rettung durch interne Verstärkungssteuerung (IAC):Die Einführung eines IAC in das qPCR-System ist eine effektive Strategie zur Erkennung der Hemmung.Es bestätigt das Vorhandensein von Matrix-Inhibitoren und nicht ein Problem mit der Zielsequenz selbst..

Abbildung 2.Beispiele für PCR-Hemmung bei qPCR.a.Amplifikationskurven, die mit zunehmenden Mengen an Fulvesäure erhalten werden, die die Amplifikation hemmt.b.Agarose-Gel-Elektrophorese entspricht den Amplifikationsreaktionen inEin.c.Verstärkungskurven, die mit zunehmenden Mengen Huminsäure erhalten werden, die die Fluoreszenz abschwächt.d.Agarose-Gel-Elektrophorese entspricht den Amplifikationsreaktionen incDie Zahlen in den Abbildungen stellen die Menge an Huminsäure oder Fulinsäure dar, die dem Reaktionsgemisch zugesetzt wird. PC (Positive Control) zeigt eine Reaktion an, bei der PCR-Hemmer durch Wasser ersetzt wurden.Der Nachweis wurde mit EvaGreen-Färbemittel durchgeführt..

Durch die Aufteilung des Reaktionsgemischs in Zehntausende von Tropfen oder Mikrokammern für die Endpunktlese ist die dPCR nicht auf Cq-Werte angewiesen.seine Toleranz gegenüber leichter Hemmung ist tatsächlich überlegen als qPCRDie Überprüfung betont jedoch ausdrücklich, dass dPCR kein universelles Heilmittel ist.

1. Grenzwerte der Trennungsverdünnung:Während die Partitionierung die Inhibitorkonzentration innerhalb einzelner Mikrokompartments reduziert, kann eine starke Inhibition in einigen Tröpfchen immer noch zu einem Verstärkungsversagen führen.Dies führt zu einer verringerten Positivquote und einer Unterschätzung der absoluten Exemplarzahl..

2. Wesentliche Unterschiede zwischen Polymerasen:Die Toleranz der Polymerasen gegenüber Inhibitoren ist sehr unterschiedlich.Die Überprüfung stellt fest, dass die Umstellung auf spezifische inhibitor-tolerante Polymerasen oder optimierte Puffer die dPCR-Toleranz gegenüber Huminsäure um mehrere Zehnfache erhöhen können..

3. Unterdrückung passiver Referenzsignale:Wenn Hämoglobin oder Huminsäure in der Probe passive Referenzfarbstoffe wie ROX löscht,Normalisierungsschwelle versagt, was zu falschen Negativen führt, wenn schwache Positive falsch klassifiziert werden.

• Umwelt Boden/Wasser:Huminsäure und Fulinsäure wirken durch zwei Mechanismen, indem sie Polymerasen hemmen und die SYBR/EvaGreen-Fluoreszenz löschen.

• Blut / Plasma:Hämoglobin, Hämin, IgG. Hämoglobin vergiftet Polymerasen direkt und löscht Farbstoffe, während IgG wie ein "Kleber" wirkt, der sich an die DNA bindet und das Glühen des Primer blockiert.

• Fäkalien / Darmproben:Galsalze, Phytsäure, Polysaccharide, die die Aktivität der Polymerase hemmen.

• Pflanzen / Lebensmittelmaterialien:Polyphenole, Tannine, Polysaccharide, Pigmente. Polyphenole binden bei der Oxidation an Proteine, während Polysaccharide die Viskosität erhöhen und mit der DNA zusammenfallen.

Bei der Behandlung von Inhibitoren verliert die traditionelle serielle Verdünnung häufig wertvolle Zielvorlagen mit geringer Häufigkeit.

1. Wechseln von Polymerasen als primäre Maßnahme:Konzentrieren Sie sich nicht nur auf "hochverlässliche" Enzyme, sondern setzen Sie Vorrang einHämmer-Toleranzfür Blutproben Blut-Toleranz-Enzyme und für Umweltbodenproben Huminsäure-Toleranz-Enzyme zu wählen.

2. Strategische Verwendung von Zusatzstoffen:

   • BSA (Bovine Serum Albumin):Wirksam bindet bestimmte Hemmstoffe, um betroffene Polymerasen zu retten, obwohl es die Farbstofflösung nicht auflöst.

   • T4 gp32 / Humusentferner:Spezialisierte Additive zur Entfernung von Inhibitoren können für komplexe Umweltmatrizen verwendet werden.

3. Anpassung der Erkennungsmethoden:Wird SYBR Green durchgängig gelöscht, sollte der Wechsel zu Hydrolyse-Sonden (z. B. TaqMan) in Betracht gezogen werden, die im Allgemeinen weniger anfällig für Matrixfluoreszenz-Interferenzen sind.

4. Verkürzung der Amplikonlänge:Bei dPCR- und gehemmten qPCR-Systemen sollte die Amplikonlänge innerhalb70 ¢ 120 bpKurze Fragmente verstärken sich unter widrigen Bedingungen deutlich effizienter als längere Ziele.