분자 진단 분야에서 일하는 사람은 아마도 다음과 같은 시나리오를 겪었을 것입니다.또는 식품 추출물 때문에 Cq 값이 갑자기 늦어집니다.. − 증폭 곡선이 나타나지만 약한 형광이 나타나지만 아가로스 젤에 명확한 목표 대역이 나타납니다. − 전체 qPCR 정량화는 과소평가됩니다.그리고 결과는 표준 곡선에서도 불안정합니다.- "디지털 PCR는 억제에 면역적입니다"라는 믿음 아래 dPCR로 전환하면 여전히 비켜지지 않은 파티션 / 방울과 절대 복사 수를 과소평가합니다.

이러한 문제들 뒤에, PCR 억제제는 종종 중심적인 역할을 합니다.분석 및 생명 분석 화학qPCR, dPCR, MPS의 억제 메커니즘을 체계적으로 설명합니다. PCR은 단순히 템플릿과 마스터 믹스를 혼합하는 것보다 훨씬 복잡합니다.동시에 in vitro DNA 폴리머화에 의존합니다., 프라이머 반열, 비정성화 / 재정성화 및 형광 검출. 매트릭스의 특정 분자가 이러한 단계 중 하나를 방해하면 결과는 왜곡 될 것입니다.

검토는 PCR의 중요한 하위 반응을 연속적인 사슬로 보여줍니다.템플릿 디너추레이션 → 프라이머 단열 결합 → 폴리메라즈 확장 → 제품 축적 → 형광 검출.

PCR 억제자는 일반적으로 샘플 매트릭스, 타겟 세포 또는 추출 반응기에서 비롯된 물질을 의미하며, 이는 실험실 중합화 또는 형광 신호를 방해합니다.

일반적인 간섭 지점은 크게 세 가지로 나눌 수 있습니다.

1. 폴리메라스를 직접적으로 공격억제제는 Taq 또는 다른 열 안정성 DNA 폴리메라즈의 활동을 감소시켜 전반적인 증폭 효율을 감소시킵니다. 초기 주기가 영향을 받으면 Cq가 지연됩니다.증폭이 완전히 실패할 수 있습니다.휴믹산, 헤모글로빈, 헤민, 담금, 피틱산, 폴리페놀은 폴리메라즈 활동을 저하시키는 전형적인 화합물입니다.

2. 핵산 / 프라이머 반열에 방해억제자는 단일 나선 (ssDNA) 또는 이중 나선 DNA (dsDNA) 에 결합하여 프라이머가 템플릿에 접근하는 것을 방지합니다. 이것은 특히 초기 사이클에 영향을 미칩니다.면역 글로불린 G (IgG) 는 대표적인 예입니다.: 유전체 ssDNA에 결합하고 프라이머 반열을 방해하여 Cq 값이 늦어집니다.

3. 불광 감지 장애이 물질 들 은 반드시 증폭 장애 를 유발 하지 않을 수 있지만, 그 물질 들 은 기구 가 신호 를 "볼 수 없게" 한다.휴믹산과 헤모글로빈은 자유로운 염료로 정적 소화 복합체를 형성할 수 있다DTT는 특정 시스템에서 수동적 참조 염색체를 끄는 역할을 한다. 이 억제 방식은 매우 속임수이다:증폭이 실제로 발생하면 (벨트들은 젤 전자기술에서 보인다), 그러나 qPCR 곡선은 지연된 시작과 감소된 플라토를 나타냅니다. dPCR에서 억제 된 수동 참조 신호는 잘못된 양성 / 부정적 임계 설정으로 이어집니다.

그림 1PCR의 주요 반응 단계의 구조적 표현 PCR 억제제는 이러한 단계 중 어느 하나에 영향을 줄 수 있습니다. 예를 들어, 프라이머 반열을 방해하여 DNA 폴리메라스 활동에 영향을 미치며,또는 형광 감지 장애.

qPCR는 절대적 또는 상대적 정량화를 위해 Cq 값 (정량화 주기) 및 표준 곡선에 의존합니다.억제자에 의한 초기 증폭 운동에 대한 간섭은 데이터 정확성에 치명적일 수 있습니다..

1. 효율성 왜곡:토양의 휴믹산이나 배설물 간 소금과 같은 억제제가 있으면 증폭 곡선의 기울기가 변합니다.계산된 효율이 90%~110%의 허용 범위를 벗어나게 하는이것은 과잉 또는 과소 정량화로 이어집니다.

2. 플루오레센스 유물:증폭 곡선이 제대로 상승하지 못하지만 아가로스 젤 전자기술이 명확한 표적 제품을 드러내면 형광 소멸이 발생할 가능성이 있습니다. 특히 SYBR 그린과 같은 염료로,휴믹산은 폴리메라세스를 억제 할뿐만 아니라 형광 강도를 크게 억제합니다..

3. 내부 증폭 제어 (IAC) 를 통한 구조:qPCR 시스템에 IAC를 도입하는 것은 억제를 감지하는 효과적인 전략입니다.그것은 목표 염기서열 자체에 문제가 아닌 매트릭스 억제자의 존재를 확인합니다.

그림 2qPCR에서 PCR 억제의 예a.증폭을 억제하는 풀브산의 증가량으로 얻은 증폭 곡선.b.아가로스 젤 전자기술a.c.플루오레센스를 끄는 힙산의 증가량으로 얻은 증폭 곡선.d.아가로스 젤 전자기술c. 그림의 숫자는 반응 혼합물에 첨가 된 휴믹 또는 풀브산의 양을 나타냅니다. PC (긍정적 통제) 는 PCR 억제제가 물로 대체 된 반응을 나타냅니다.EvaGreen 색소를 사용하여 검출되었습니다..

반응 혼합물을 수만 개의 방울이나 마이크로 챔버로 분할하여 종점 판독을 통해 dPCR는 Cq 값에 의존하지 않습니다. 결과적으로,가벼운 억제에 대한 내성이 qPCR보다 더 강합니다.그러나 이 리뷰 는 dPCR가 보편적 치료법 이 아니라는 점 을 명시적 으로 강조 합니다.

1. 분할 희석 한계:분할은 개별 마이크로 칸막이에 억제자의 농도를 감소시키지만 강한 억제는 여전히 일부 방울에서 증폭 실패를 일으킬 수 있습니다.음률이 낮아지고 절대적인 복사본 수가 낮아지는 결과를 초래합니다..

2. 폴리메라제들 사이의 실질적인 차이점:폴리메라즈는 억제제에 대한 내성이 크게 달라집니다.리뷰는 특정 억제기 내성 폴리메라세스 또는 최적화된 버퍼로 전환하면 humic acid에 대한 dPCR 내성을 10 배 증가시킬 수 있다고 지적합니다..

3. 소극적 참조 신호의 억제:dPCR는 플루오레센스 경계에 의존하여 양과 음의 파티션을 구별합니다. 샘플의 헤모글로빈이나 휴믹산이 ROX와 같은 수동적인 참조 염색체를 끄는 경우,임계 정상화 실패, 약한 긍정이 잘못 분류되는 잘못된 부정으로 이어집니다.

• 환경 토양/물:휴믹산, 풀빅산 이 둘은 이중 메커니즘을 통해 작용합니다. 양쪽 모두 폴리메라세스를 억제하고 SYBR/EvaGreen 형광을 끄는 것입니다.

• 혈액 / 플라스마:헤모글로빈, 헤민, IgG. 헤모글로빈은 직접적으로 폴리메라세스를 독살하고 염색제를 소멸시키는데, IgG는 DNA에 결합하는 "고착제"처럼 작용하여 프라이머 굽기를 차단합니다.

• 배설물 / 장 샘플:간 소금, 피틱산, 폴리사카리드, 주로 폴리메라즈 활동을 억제해서 증폭효율이 낮습니다

• 식물/식품 재료:폴리페놀, 타닌, 폴리사카라이드, 색소. 폴리페놀은 산화 시 단백질에 결합하고 폴리사카라이드는 점도를 증가시키고 DNA와 함께 침착합니다.

억제제에 대 한 전통적인 연쇄 희석 은 종종 귀중 한 저 빈도 대상 템플릿 을 잃는다. 다음 실용적 인 전략의 조합이 권장된다:

1. 폴리메라세스 전환은 주요 조치입니다."높은 신뢰성"의 효소에만 집중하지 말고 우선 순위를 두십시오억제기 내성폴리메라세스: 혈액 샘플에 혈액 내성이 있는 효소와 환경 토양 샘플에 휴믹산 내성이 있는 효소를 선택합니다.

2. 첨가물의 전략적 사용:

   • BSA (고양의 혈청 알부민):일부 억제 물질을 효과적으로 결합하여 영향을 받은 폴리메라세스를 구출하지만 염료 소멸을 해결하지 않습니다.

   • T4 gp32 / 휴믹 제거 물질:특수 억제 제거 첨가물은 복잡한 환경 행렬에 사용될 수 있습니다.

3. 탐지 방법을 조정:SYBR Green가 지속적으로 끄는 경우 일반적으로 행렬 형광 간섭에 덜 민감한 수분분석 프로브 (예를 들어 TaqMan) 로 전환하는 것을 고려하십시오.

4. 앰플리콘 길이를 줄이는 것:dPCR 및 억제 qPCR 시스템에서는 amplicon 길이를70~120 bp더 짧은 조각은 더 긴 목표물과 비교하여 불리한 조건에서 훨씬 더 높은 효율으로 증폭합니다.