Qualquer pessoa que trabalhe em diagnóstico molecular provavelmente já se deparou com estes cenários: − Os padrões funcionam perfeitamente, mas a mudança para solo, fezes, sangue total, plantas ou extratos alimentares faz com que o valor Cq seja subitamente atrasado. − Surgem curvas de amplificação, mas com fluorescência fraca, mas bandas alvo claras aparecem em um gel de agarose. − A quantificação geral do qPCR é subestimada e os resultados permanecem instáveis ​​mesmo com uma curva padrão. − Mudar para dPCR sob a crença de que “o PCR digital é imune à inibição” ainda resulta em partições/gotículas apagadas e números absolutos de cópias subestimados.

Por trás destas questões, os inibidores de PCR desempenham frequentemente um papel central. Uma resenha publicada emQuímica Analítica e Bioanalíticadescreve sistematicamente os mecanismos de inibição em qPCR, dPCR e MPS: PCR é muito mais complexo do que simplesmente misturar um modelo com uma mistura mestre. Ele depende simultaneamente de polimerização de DNA in vitro, recozimento de primer, desnaturação/renaturação e detecção de fluorescência. Se certas moléculas na matriz interferirem em qualquer uma dessas etapas, os resultados ficarão distorcidos.

A revisão ilustra as sub-reações críticas da PCR como uma cadeia contínua:Desnaturação do modelo → Ligação de fita simples de primer → Extensão de polimerase → Acumulação de produto → Detecção de fluorescência.

Um inibidor de PCR geralmente se refere a qualquer substância originária da matriz da amostra, células alvo ou reagentes de extração que interfira na polimerização in vitro ou na sinalização de fluorescência.

Os pontos comuns de interferência se enquadram em três categorias principais:

1. Visando diretamente a polimeraseOs inibidores reduzem a atividade da Taq ou de outras DNA polimerases termoestáveis, diminuindo a eficiência geral da amplificação. Quando os ciclos iniciais são afetados, o Cq é atrasado; quando totalmente afetada, a amplificação pode falhar totalmente. Ácido húmico, hemoglobina, hemina, sais biliares, ácido fítico e polifenóis são compostos típicos que prejudicam a atividade da polimerase.

2. Interferindo com Ácidos Nucleicos / Recozimento de PrimerOs inibidores se ligam ao DNA de fita simples (ssDNA) ou de fita dupla (dsDNA), impedindo que os primers acessem o modelo. Isto afeta particularmente os ciclos iniciais. A imunoglobulina G (IgG) é um exemplo clássico: ela se liga ao ssDNA genômico e interrompe o recozimento do primer, levando a valores atrasados ​​de Cq.

3. Interrompendo a detecção de fluorescênciaEstas substâncias podem não causar necessariamente falha na amplificação, mas tornam o instrumento “incapaz de ver” o sinal. O ácido húmico e a hemoglobina podem formar complexos de extinção estática com corantes livres, suprimindo sinais de SYBR Green I, EvaGreen, ResoLight, ROX e outros. O DTT pode extinguir corantes de referência passivos em certos sistemas. Este modo de inibição é altamente enganoso: a amplificação realmente ocorre (as bandas são visíveis na eletroforese em gel), mas a curva qPCR mostra um início retardado e um platô reduzido; no dPCR, os sinais de referência passivos suprimidos levam a configurações incorretas de limites positivos/negativos.

Figura 1.Representação esquemática das principais etapas da reação em PCR. Os inibidores de PCR podem afetar qualquer uma dessas etapas, por exemplo, interferindo no recozimento do iniciador, afetando a atividade da DNA polimerase ou prejudicando a detecção de fluorescência.

qPCR depende de valores Cq (ciclo de quantificação) e curvas padrão para quantificação absoluta ou relativa. Consequentemente, a interferência na cinética de amplificação precoce pelos inibidores pode ser fatal para a precisão dos dados.

1. Distorção de eficiência:Na presença de inibidores como ácido húmico do solo ou sais biliares fecais, a inclinação da curva de amplificação muda, fazendo com que a eficiência calculada fique fora da faixa aceitável de 90% a 110%. Isso leva à super ou subquantificação.

2. Artefatos de fluorescência:Se as curvas de amplificação não aumentarem adequadamente, mas a eletroforese em gel de agarose revelar produtos alvo claros, é provável que ocorra a extinção da fluorescência. Particularmente com corantes como o SYBR Green, o ácido húmico não apenas inibe as polimerases, mas também suprime significativamente a intensidade da fluorescência.

3. Resgate via controles internos de amplificação (IAC):A introdução de um IAC no sistema qPCR é uma estratégia eficaz para detectar a inibição. Se tanto o IAC como o sinal alvo forem atrasados ​​simultaneamente, isso confirma a presença de inibidores de matriz em vez de um problema com a própria sequência alvo.

Figura 2.Exemplos de inibição de PCR em qPCR.um.Curvas de amplificação obtidas com quantidades crescentes de ácido fúlvico, que inibe a amplificação.b.Eletroforese em gel de agarose correspondente às reações de amplificação emum.c.Curvas de amplificação obtidas com quantidades crescentes de ácido húmico, que extingue a fluorescência.d.Eletroforese em gel de agarose correspondente às reações de amplificação emc. Os números nas figuras representam a quantidade de ácido húmico ou fúlvico adicionado à mistura reaccional. PC (Controle Positivo) indica uma reação em que o inibidor de PCR foi substituído por água. A detecção foi realizada utilizando o corante EvaGreen.

Ao particionar a mistura de reação em dezenas de milhares de gotículas ou microcâmaras para leitura do ponto final, o dPCR não depende de valores de Cq. Como resultado, a sua tolerância à inibição moderada é de facto superior à qPCR. Contudo, a revisão enfatiza explicitamente que o dPCR não é uma cura universal.

1. Limites de diluição de particionamento:Embora o particionamento reduza a concentração do inibidor dentro dos microcompartimentos individuais, a forte inibição ainda pode causar falha na amplificação em algumas gotículas, levando a uma diminuição da taxa positiva e a uma subestimação do número absoluto de cópias.

2. Diferenças substanciais entre polimerases:As polimerases variam dramaticamente em sua tolerância aos inibidores. A revisão observa que a mudança para polimerases tolerantes a inibidores específicos ou tampões otimizados pode aumentar a tolerância do dPCR ao ácido húmico em dez vezes.

3. Supressão de Sinais de Referência Passivos:dPCR depende de limiares de fluorescência para distinguir partições positivas de negativas. Se a hemoglobina ou o ácido húmico na amostra extinguirem os corantes de referência passivos como o ROX, a normalização do limiar falhará, levando a falsos negativos, onde os positivos fracos serão classificados incorretamente.

• Solo/Água Ambiental:Ácido húmico, ácido fúlvico. Eles agem através de mecanismos duplos, inibindo polimerases e extinguindo a fluorescência SYBR/EvaGreen.

• Sangue/Plasma:Hemoglobina, hemina, IgG. A hemoglobina envenena diretamente as polimerases e extingue os corantes, enquanto a IgG atua como uma "cola" que se liga ao DNA e bloqueia o recozimento do primer.

• Fezes/amostras intestinais:Sais biliares, ácido fítico, polissacarídeos. Eles inibem principalmente a atividade da polimerase, resultando em baixa eficiência de amplificação.

• Plantas / Materiais Alimentares:Polifenóis, taninos, polissacarídeos, pigmentos. Os polifenóis ligam-se às proteínas após a oxidação, enquanto os polissacarídeos aumentam a viscosidade e co-precipitam com o DNA.

Ao lidar com inibidores, a diluição serial tradicional muitas vezes perde preciosos modelos alvo de baixa abundância. Recomenda-se uma combinação das seguintes estratégias práticas:

1. Troca de polimerases como medida primária:Não se concentre apenas em enzimas de “alta fidelidade”; priorizartolerante a inibidorespolimerases. Escolha enzimas tolerantes ao sangue para amostras de sangue e enzimas tolerantes a ácidos húmicos para amostras ambientais de solo.

2. Uso Estratégico de Aditivos:

   • BSA (albumina de soro bovino):Liga-se efetivamente a certas substâncias inibitórias para resgatar polimerases afetadas, embora não resolva a extinção do corante.

   • T4 gp32 / Agentes de remoção húmica:Aditivos especializados para remoção de inibidores podem ser utilizados para matrizes ambientais complexas.

3. Ajustando métodos de detecção:Se o SYBR Green for consistentemente extinto, considere mudar para sondas de hidrólise (por exemplo, TaqMan), que geralmente são menos suscetíveis à interferência de fluorescência da matriz.

4. Encurtando o comprimento do amplicon:Em sistemas dPCR e qPCR inibidos, mantenha os comprimentos do amplicon dentro70–120 pb. Fragmentos mais curtos amplificam com eficiência significativamente maior sob condições adversas em comparação com alvos mais longos.