Chiunque lavori nel campo della diagnostica molecolare si è probabilmente imbattuto in questi scenari: − Gli standard funzionano perfettamente, ma il passaggio a terreno, feci, sangue intero, piante o estratti alimentari provoca un improvviso ritardo del valore Cq. − Emergono curve di amplificazione ma con debole fluorescenza, ma su un gel di agarosio compaiono bande target chiare. − La quantificazione complessiva della qPCR è sottostimata e i risultati rimangono instabili anche con una curva standard. − Il passaggio alla dPCR nella convinzione che "la PCR digitale sia immune all'inibizione" comporta ancora partizioni/goccioline non illuminate e numeri di copie assoluti sottostimati.

Dietro questi problemi, gli inibitori della PCR svolgono spesso un ruolo centrale. Una recensione pubblicata inChimica Analitica e Bioanaliticadelinea sistematicamente i meccanismi di inibizione attraverso qPCR, dPCR e MPS: la PCR è molto più complessa della semplice miscelazione di un modello con una master mix. Si basa contemporaneamente sulla polimerizzazione del DNA in vitro, sulla ricottura dei primer, sulla denaturazione/rinaturazione e sul rilevamento della fluorescenza. Se alcune molecole nella matrice interferiscono con uno qualsiasi di questi passaggi, i risultati risulteranno distorti.

La revisione illustra le sottoreazioni critiche della PCR come una catena continua:Denaturazione del modello → Legame primer a filamento singolo → Estensione della polimerasi → Accumulo del prodotto → Rilevamento della fluorescenza.

Un inibitore della PCR si riferisce generalmente a qualsiasi sostanza proveniente dalla matrice del campione, dalle cellule bersaglio o dai reagenti di estrazione che interferisce con la polimerizzazione in vitro o la segnalazione della fluorescenza.

I punti comuni di interferenza rientrano in tre categorie principali:

1. Mirare direttamente alla polimerasiGli inibitori riducono l'attività della Taq o di altre DNA polimerasi termostabili, diminuendo l'efficienza complessiva dell'amplificazione. Quando vengono colpiti i primi cicli, il Cq viene ritardato; se influenzata completamente, l'amplificazione potrebbe fallire completamente. L'acido umico, l'emoglobina, l'emina, i sali biliari, l'acido fitico e i polifenoli sono composti tipici che compromettono l'attività della polimerasi.

2. Interferenza con gli acidi nucleici/ricottura del primerGli inibitori si legano al DNA a filamento singolo (ssDNA) o a doppio filamento (dsDNA), impedendo ai primer di accedere al modello. Ciò ha un impatto particolarmente sui cicli iniziali. L'immunoglobulina G (IgG) è un classico esempio: si lega allo ssDNA genomico e interrompe la ricottura dei primer, portando a valori Cq ritardati.

3. Rilevamento della fluorescenza disturbanteQueste sostanze potrebbero non causare necessariamente un guasto all'amplificazione, ma rendono lo strumento "incapace di vedere" il segnale. L'acido umico e l'emoglobina possono formare complessi di spegnimento statico con coloranti liberi, sopprimendo i segnali di SYBR Green I, EvaGreen, ResoLight, ROX e altri. DTT può estinguere i coloranti di riferimento passivi in ​​alcuni sistemi. Questa modalità di inibizione è altamente ingannevole: l'amplificazione avviene effettivamente (le bande sono visibili sull'elettroforesi su gel), ma la curva qPCR mostra un inizio ritardato e un plateau ridotto; nella dPCR, i segnali di riferimento passivi soppressi portano a impostazioni errate della soglia positiva/negativa.

Figura 1.Rappresentazione schematica delle fasi chiave della reazione nella PCR. Gli inibitori della PCR possono influenzare qualsiasi di questi passaggi, ad esempio, interferendo con la ricottura dei primer, influenzando l'attività della DNA polimerasi o compromettendo il rilevamento della fluorescenza.

La qPCR si basa sui valori Cq (ciclo di quantificazione) e sulle curve standard per la quantificazione assoluta o relativa. Di conseguenza, l’interferenza con la cinetica di amplificazione precoce da parte degli inibitori può essere fatale per l’accuratezza dei dati.

1. Distorsione dell'efficienza:In presenza di inibitori come l’acido umico del suolo o i sali biliari fecali, la pendenza della curva di amplificazione cambia, facendo sì che l’efficienza calcolata non rientri nell’intervallo accettabile del 90%–110%. Ciò porta a una quantificazione eccessiva o insufficiente.

2. Artefatti di fluorescenza:Se le curve di amplificazione non riescono a salire correttamente ma l'elettroforesi su gel di agarosio rivela prodotti target chiari, è probabile che si verifichi l'estinzione della fluorescenza. In particolare con coloranti come SYBR Green, l'acido umico non solo inibisce la polimerasi ma sopprime anche significativamente l'intensità della fluorescenza.

3. Salvataggio tramite controlli di amplificazione interni (IAC):L'introduzione di uno IAC nel sistema qPCR è una strategia efficace per rilevare l'inibizione. Se sia lo IAC che il segnale target vengono ritardati simultaneamente, ciò conferma la presenza di inibitori della matrice piuttosto che un problema con la sequenza target stessa.

Figura 2.Esempi di inibizione della PCR in qPCR.UN.Curve di amplificazione ottenute con quantità crescenti di acido fulvico, che inibisce l'amplificazione.B.Elettroforesi su gel di agarosio corrispondente alle reazioni di amplificazione inUN.C.Curve di amplificazione ottenute con quantità crescenti di acido umico, che spegne la fluorescenza.D.Elettroforesi su gel di agarosio corrispondente alle reazioni di amplificazione inC. I numeri nelle figure rappresentano la quantità di acido umico o fulvico aggiunta alla miscela di reazione. PC (controllo positivo) indica una reazione in cui l'inibitore della PCR è stato sostituito con acqua. Il rilevamento è stato eseguito utilizzando il colorante EvaGreen.

Suddividendo la miscela di reazione in decine di migliaia di goccioline o microcamere per la lettura del punto finale, dPCR non si basa sui valori Cq. Di conseguenza, la sua tolleranza all’inibizione lieve è effettivamente superiore alla qPCR. Tuttavia, la revisione sottolinea esplicitamente che la dPCR non è una cura universale.

1. Limiti di diluizione del partizionamento:Sebbene il partizionamento riduca la concentrazione dell'inibitore all'interno dei singoli microcompartimenti, una forte inibizione può comunque causare un fallimento dell'amplificazione in alcune goccioline, portando a una diminuzione del tasso di positività e a una sottostima del numero di copie assolute.

2. Differenze sostanziali tra le polimerasi:Le polimerasi variano notevolmente nella loro tolleranza agli inibitori. La revisione rileva che il passaggio a specifiche polimerasi tolleranti agli inibitori o a tamponi ottimizzati può aumentare la tolleranza della dPCR all’acido umico di diverse dieci volte.

3. Soppressione dei segnali di riferimento passivi:La dPCR si basa sulle soglie di fluorescenza per distinguere le partizioni positive da quelle negative. Se l'emoglobina o l'acido umico nel campione estingue i coloranti di riferimento passivi come ROX, la normalizzazione della soglia fallisce, portando a falsi negativi in ​​cui i positivi deboli vengono classificati erroneamente.

• Ambiente Suolo/Acqua:Acido umico, acido fulvico. Agiscono attraverso un duplice meccanismo, inibendo le polimerasi e attenuando la fluorescenza SYBR/EvaGreen.

• Sangue/Plasma:Emoglobina, emina, IgG. L'emoglobina avvelena direttamente le polimerasi e spegne i coloranti, mentre le IgG agiscono come una "colla" legandosi al DNA e bloccando la ricottura del primer.

• Feci / Campioni intestinali:Sali biliari, acido fitico, polisaccaridi. Inibiscono principalmente l'attività della polimerasi, con conseguente bassa efficienza di amplificazione.

• Piante/Materiali alimentari:Polifenoli, tannini, polisaccaridi, pigmenti. I polifenoli legano le proteine ​​durante l'ossidazione, mentre i polisaccaridi aumentano la viscosità e co-precipitano con il DNA.

Quando si ha a che fare con gli inibitori, la diluizione seriale tradizionale spesso perde preziosi modelli target a bassa abbondanza. Si consiglia una combinazione delle seguenti strategie pratiche:

1. Cambiare le polimerasi come misura primaria:Non concentrarti esclusivamente sugli enzimi "ad alta fedeltà"; dare la prioritàtollerante agli inibitoripolimerasi. Scegli enzimi tolleranti al sangue per i campioni di sangue ed enzimi tolleranti agli acidi umici per i campioni di terreno ambientale.

2. Uso strategico degli additivi:

   • BSA (albumina sierica bovina):Lega efficacemente alcune sostanze inibitorie per salvare le polimerasi colpite, sebbene non risolva l'estinzione del colorante.

   • T4 gp32 / Agenti di rimozione umici:Additivi specializzati per la rimozione degli inibitori possono essere utilizzati per matrici ambientali complesse.

3. Regolazione dei metodi di rilevamento:Se SYBR Green viene costantemente spento, valutare la possibilità di passare alle sonde di idrolisi (ad esempio, TaqMan), che generalmente sono meno suscettibili all'interferenza della fluorescenza della matrice.

4. Accorciamento della lunghezza dell'amplicone:Nei sistemi dPCR e qPCR inibiti, mantenere le lunghezze degli ampliconi entro i limiti70-120 punti di partenza. I frammenti più corti si amplificano con efficienza significativamente più elevata in condizioni avverse rispetto ai target più lunghi.