Iedereen die werkzaam is in de moleculaire diagnostiek heeft waarschijnlijk deze scenario's meegemaakt: − Standaarden werken perfect, maar bij overschakeling naar extracten van grond, feces, volbloed, planten of voedsel is de Cq-waarde plotseling vertraagd. − Amplificatiecurves verschijnen, maar met zwakke fluorescentie, terwijl duidelijke doelbanden verschijnen op een agarosegel. − De algehele qPCR-kwantificatie wordt onderschat en de resultaten blijven instabiel, zelfs met een standaardcurve. − Overschakelen naar dPCR in de overtuiging dat "digitale PCR immuun is voor remming" resulteert nog steeds in niet-verlichte partities/druppeltjes en onderschatte absolute kopieaantallen.

Achter deze problemen spelen PCR-remmers vaak een centrale rol. Een recensie gepubliceerd in Analytical and Bioanalytical Chemistry schetst systematisch de mechanismen van remming in qPCR, dPCR en MPS: PCR is veel complexer dan simpelweg een template mengen met een mastermix. Het is tegelijkertijd afhankelijk van in vitro DNA-polymerisatie, primer annealing, denaturatie/renaturatie en fluorescentiedetectie. Als bepaalde moleculen in de matrix een van deze stappen verstoren, zullen de resultaten vervormd raken.

De recensie illustreert de kritieke subreacties van PCR als een continue keten: Template Denaturatie → Primer-Single-Strand Binding → Polymerase Extensie → Product Accumulatie → Fluorescentie Detectie.

Een PCR-remmer verwijst over het algemeen naar elke stof die afkomstig is van de monster matrix, doelcellen of extractiereagentia die de in vitro polymerisatie of de fluorescentiesignalen verstoort.

Veelvoorkomende interferentiepunten vallen in drie hoofdcategorieën:

1. Directe targeting van de polymerase Remmers verminderen de activiteit van Taq of andere thermolabiele DNA-polymerases, waardoor de algehele amplificatie-efficiëntie afneemt. Wanneer vroege cycli worden beïnvloed, is de Cq vertraagd; wanneer gedurende de gehele cyclus wordt beïnvloed, kan de amplificatie volledig mislukken. Humuszuren, hemoglobine, heem, galzouten, fytinezuur en polyfenolen zijn typische verbindingen die de polymerase-activiteit aantasten.

2. Interferentie met nucleïnezuren / primer annealing Remmers binden aan enkelstrengs (ssDNA) of dubbelstrengs DNA (dsDNA), waardoor primers de template niet kunnen benaderen. Dit beïnvloedt met name de initiële cycli. Immunoglobuline G (IgG) is een klassiek voorbeeld: het bindt aan genomisch ssDNA en verstoort primer annealing, wat leidt tot vertraagde Cq-waarden.

3. Verstoring van fluorescentiedetectie Deze stoffen veroorzaken niet noodzakelijkerwijs amplificatie-falen, maar ze maken het instrument "niet in staat om" het signaal te "zien". Humuszuren en hemoglobine kunnen statische quenchingscomplexen vormen met vrije kleurstoffen, waardoor signalen van SYBR Green I, EvaGreen, ResoLight, ROX en andere worden onderdrukt. DTT kan passieve referentiekleurstoffen in bepaalde systemen quenchen. Deze vorm van remming is zeer misleidend: amplificatie vindt daadwerkelijk plaats (banden zijn zichtbaar op gel-elektroforese), maar de qPCR-curve vertoont een vertraagde aanvang en een verminderd plateau; in dPCR leiden onderdrukte passieve referentiemetingen tot onjuiste drempelinstellingen voor positief/negatief.

Figuur 1. Schematische weergave van de belangrijkste reactiestappen in PCR. PCR-remmers kunnen elke van deze stappen beïnvloeden door bijvoorbeeld interferentie met primer annealing, beïnvloeding van de DNA-polymerase-activiteit of aantasting van de fluorescentiedetectie.

qPCR is afhankelijk van Cq-waarden (kwantificatiecyclus) en standaardcurves voor absolute of relatieve kwantificatie. Bijgevolg kan interferentie met vroege amplificatiekinetiek door remmers fataal zijn voor de nauwkeurigheid van de gegevens.

1. Efficiëntievervorming: In aanwezigheid van remmers zoals humuszuren uit grond of galzouten uit feces, verandert de helling van de amplificatiecurve, waardoor de berekende efficiëntie buiten het acceptabele bereik van 90%-110% valt. Dit leidt tot over- of onderkwantificatie.

2. Fluorescentie-artefacten: Als amplificatiecurves niet goed stijgen, maar agarosegel-elektroforese duidelijke doelproducten onthult, treedt waarschijnlijk fluorescentie quenching op. Vooral met kleurstoffen zoals SYBR Green remt humuszuur niet alleen polymerases, maar onderdrukt het ook de fluorescentie-intensiteit aanzienlijk.

3. Redding via interne amplificatiecontroles (IAC): Het introduceren van een IAC in het qPCR-systeem is een effectieve strategie om remming te detecteren. Als zowel het IAC- als het doelsignaal tegelijkertijd worden vertraagd, bevestigt dit de aanwezigheid van matrixremmers in plaats van een probleem met de doelsequentie zelf.

Figuur 2. Voorbeelden van PCR-remming in qPCR. a. Amplificatiecurves verkregen met toenemende hoeveelheden fulvinezuur, dat de amplificatie remt. b. Agarosegel-elektroforese die overeenkomt met de amplificatiereacties in a. c. Amplificatiecurves verkregen met toenemende hoeveelheden humuszuren, dat fluorescentie quenchet. d. Agarosegel-elektroforese die overeenkomt met de amplificatiereacties in c. De cijfers in de figuren vertegenwoordigen de hoeveelheid humuszuren of fulvinezuur die aan het reactiemengsel is toegevoegd. PC (Positieve Controle) geeft een reactie aan waarbij de PCR-remmer is vervangen door water. Detectie werd uitgevoerd met EvaGreen kleurstof.

Door het reactiemengsel te verdelen in tienduizenden druppeltjes of microkamers voor endpoint-uitlezing, is dPCR niet afhankelijk van Cq-waarden. Als gevolg hiervan is de tolerantie voor milde remming inderdaad superieur aan qPCR. De recensie benadrukt echter expliciet dat dPCR geen universele oplossing is.

1. Verdelingsverdunningslimieten: Hoewel verdeling de remmerconcentratie binnen individuele microcompartimenten vermindert, kan sterke remming nog steeds amplificatie-falen in sommige druppeltjes veroorzaken, wat leidt tot een verminderd positief percentage en een onderschatting van absolute kopieaantallen.

2. Aanzienlijke verschillen tussen polymerases: Polymerases variëren dramatisch in hun tolerantie voor remmers. De recensie merkt op dat overschakelen naar specifieke remmer-tolerante polymerases of geoptimaliseerde buffers de dPCR-tolerantie voor humuszuren met tienvoudig kan verhogen.

3. Onderdrukking van passieve referentiemetingen: dPCR is afhankelijk van fluorescentiedrempels om positieve van negatieve partities te onderscheiden. Als hemoglobine of humuszuren in het monster passieve referentiekleurstoffen zoals ROX quenchet, faalt de drempelnormalisatie, wat leidt tot valse negatieven waarbij zwakke positieven verkeerd worden geclassificeerd.

• Milieu Grond / Water: Humuszuren, fulvinezuur. Ze werken via dubbele mechanismen, zowel het remmen van polymerases als het quenchen van SYBR/EvaGreen fluorescentie.

• Bloed / Plasma: Hemoglobine, heem, IgG. Hemoglobine vergiftigt direct polymerases en quenchet kleurstoffen, terwijl IgG werkt als een "lijm" die zich bindt aan DNA en primer annealing blokkeert.

• Feces / Intestinale Monsters: Galzouten, fytinezuur, polysacchariden. Ze remmen voornamelijk de polymerase-activiteit, wat resulteert in een lage amplificatie-efficiëntie.

• Planten / Voedselmaterialen: Polyfenolen, tannines, polysacchariden, pigmenten. Polyfenolen binden eiwitten na oxidatie, terwijl polysacchariden de viscositeit verhogen en co-precipiteren met DNA.

Bij het omgaan met remmers gaan traditionele seriële verdunningen vaak verloren met kostbare laag-abundante doeltemplates. Een combinatie van de volgende praktische strategieën wordt aanbevolen:

1. Overschakelen van Polymerases als Primaire Maatregel: Concentreer u niet uitsluitend op "high-fidelity" enzymen; geef prioriteit aan remmer-tolerante polymerases. Kies bloed-tolerante enzymen voor bloedmonsters en humuszuren-tolerante enzymen voor bodemmonsters uit het milieu.

2. Strategisch Gebruik van Additieven:

   • BSA (Bovine Serum Albumin): Bindt effectief bepaalde remmende stoffen om aangetaste polymerases te redden, hoewel het geen kleurstof quenching oplost.

   • T4 gp32 / Humuszuren Verwijderingsmiddelen: Gespecialiseerde remmerverwijderingsadditieven kunnen worden gebruikt voor complexe milieu-matrices.

3. Aanpassen van Detectiemethoden: Als SYBR Green consequent wordt gequenchet, overweeg dan om over te schakelen op hydrolyseprobes (bijv. TaqMan), die over het algemeen minder gevoelig zijn voor matrix fluorescentie-interferentie.

4. Verkorten van Amplicon Lengte: In dPCR en geremde qPCR-systemen, houd ampliconlengtes binnen 70–120 bp. Kortere fragmenten amplificeren met significant hogere efficiëntie onder ongunstige omstandigheden vergeleken met langere doelen.