Любой, кто работает в области молекулярной диагностики, вероятно, сталкивался с такими сценариями: − Стандарты работают идеально, но при переходе к экстрактам почвы, кала, цельной крови, растений или пищевых продуктов значение Cq внезапно задерживается. − Кривые амплификации появляются, но со слабой флуоресценцией, хотя на агарозном геле видны четкие полосы мишени. − Общая количественная оценка ПЦР занижена, и результаты остаются нестабильными даже при использовании стандартной кривой. − Переход на dPCR с убеждением, что «цифровая ПЦР невосприимчива к ингибированию», по-прежнему приводит к незажженным разделам/каплям и заниженным абсолютным числам копий.

За этими проблемами часто стоят ингибиторы ПЦР. Обзор, опубликованный в Analytical and Bioanalytical Chemistry систематически описывает механизмы ингибирования в qPCR, dPCR и MPS: ПЦР гораздо сложнее, чем просто смешивание матрицы с мастер-миксом. Она одновременно зависит от in vitro ДНК-полимеризации, отжига праймеров, денатурации/ренатурации и детекции флуоресценции. Если определенные молекулы в матрице вмешиваются в любой из этих этапов, результаты будут искажены.

В обзоре критические суб-реакции ПЦР представлены как непрерывная цепь: Денатурация матрицы → Связывание одноцепочечной ДНК с праймером → Элонгация полимеразой → Накопление продукта → Детекция флуоресценции.

Ингибитор ПЦР обычно относится к любому веществу, происходящему из матрицы образца, целевых клеток или реагентов для экстракции, которое вмешивается в in vitro полимеризацию или флуоресцентное сигнализирование.

Общие точки вмешательства делятся на три основные категории:

1. Прямое воздействие на полимеразу Ингибиторы снижают активность Taq или других термостабильных ДНК-полимераз, снижая общую эффективность амплификации. Когда затрагиваются ранние циклы, Cq задерживается; когда затрагиваются все циклы, амплификация может полностью не произойти. Гуминовая кислота, гемоглобин, гемин, желчные соли, фитиновая кислота и полифенолы являются типичными соединениями, которые нарушают активность полимеразы.

2. Вмешательство в нуклеиновые кислоты / отжиг праймеров Ингибиторы связываются с одноцепочечной (ssDNA) или двуцепочечной ДНК (dsDNA), препятствуя доступу праймеров к матрице. Это особенно влияет на начальные циклы. Иммуноглобулин G (IgG) является классическим примером: он связывается с геномной ssDNA и нарушает отжиг праймеров, что приводит к задержке значений Cq.

3. Нарушение детекции флуоресценции Эти вещества не обязательно вызывают сбой амплификации, но они делают прибор «неспособным видеть» сигнал. Гуминовая кислота и гемоглобин могут образовывать комплексы статического тушения со свободными красителями, подавляя сигналы от SYBR Green I, EvaGreen, ResoLight, ROX и других. DTT может тушить пассивные референсные красители в некоторых системах. Этот режим ингибирования очень обманчив: амплификация фактически происходит (полосы видны на гель-электрофорезе), но кривая qPCR показывает задержку начала и сниженное плато; в dPCR, подавленные сигналы пассивного референса приводят к неправильным настройкам пороговых значений для положительных/отрицательных результатов.

Рисунок 1. Схематическое представление ключевых этапов реакции в ПЦР. Ингибиторы ПЦР могут влиять на любой из этих этапов, например, вмешиваясь в отжиг праймеров, влияя на активность ДНК-полимеразы или нарушая детекцию флуоресценции.

qPCR полагается на значения Cq (цикл количественной оценки) и стандартные кривые для абсолютной или относительной количественной оценки. Следовательно, вмешательство в кинетику ранней амплификации ингибиторами может быть фатальным для точности данных.

1. Искажение эффективности: В присутствии ингибиторов, таких как гуминовая кислота почвы или желчные соли кала, наклон кривой амплификации изменяется, вызывая выход рассчитанной эффективности за допустимый диапазон 90%–110%. Это приводит либо к чрезмерной, либо к недостаточной количественной оценке.

2. Флуоресцентные артефакты: Если кривые амплификации не поднимаются должным образом, но гель-электрофорез показывает четкие продукты мишени, вероятно, происходит тушение флуоресценции. Особенно с красителями, такими как SYBR Green, гуминовая кислота не только ингибирует полимеразы, но и значительно подавляет интенсивность флуоресценции.

3. Спасение с помощью внутренних контролей амплификации (IAC): Введение IAC в систему qPCR является эффективной стратегией для обнаружения ингибирования. Если и IAC, и сигнал мишени задерживаются одновременно, это подтверждает наличие ингибиторов матрицы, а не проблему с самой последовательностью мишени.

Рисунок 2. Примеры ингибирования ПЦР в qPCR. a. Кривые амплификации, полученные с возрастающими количествами фульвовой кислоты, которая ингибирует амплификацию. b. Гель-электрофорез агарозы, соответствующий реакциям амплификации в a. c. Кривые амплификации, полученные с возрастающими количествами гуминовой кислоты, которая тушит флуоресценцию. d. Гель-электрофорез агарозы, соответствующий реакциям амплификации в c. Цифры на рисунках обозначают количество гуминовой или фульвовой кислоты, добавленной в реакционную смесь. PC (Положительный контроль) обозначает реакцию, в которой ингибитор ПЦР был заменен водой. Детекция проводилась с использованием красителя EvaGreen.

Разделяя реакционную смесь на десятки тысяч капель или микрокамер для конечного считывания, dPCR не полагается на значения Cq. В результате его устойчивость к умеренному ингибированию действительно превосходит qPCR. Однако в обзоре явно подчеркивается, что dPCR не является универсальным решением.

1. Ограничения разбавления при разделении: Хотя разделение снижает концентрацию ингибитора в отдельных микро-отсеках, сильное ингибирование все же может вызвать сбой амплификации в некоторых каплях, что приведет к снижению положительной частоты и недооценке абсолютных чисел копий.

2. Существенные различия между полимеразами: Полимеразы значительно различаются по своей устойчивости к ингибиторам. В обзоре отмечается, что переход на специфические полимеразы, устойчивые к ингибиторам, или оптимизированные буферы может повысить устойчивость dPCR к гуминовой кислоте в десятки раз.

3. Подавление сигналов пассивного референса: dPCR полагается на флуоресцентные пороги для различения положительных и отрицательных разделов. Если гемоглобин или гуминовая кислота в образце тушат пассивные референсные красители, такие как ROX, нормализация пороговых значений не удается, что приводит к ложноотрицательным результатам, когда слабые положительные результаты классифицируются неправильно.

• Экологическая почва / вода: Гуминовая кислота, фульвовая кислота. Они действуют по двойным механизмам, как ингибируя полимеразы, так и туша флуоресценцию SYBR/EvaGreen.

• Кровь / Плазма: Гемоглобин, гемин, IgG. Гемоглобин напрямую отравляет полимеразы и тушит красители, в то время как IgG действует как «клей», связываясь с ДНК и блокируя отжиг праймеров.

• Кал / кишечные образцы: Желчные соли, фитиновая кислота, полисахариды. Они в основном ингибируют активность полимеразы, приводя к низкой эффективности амплификации.

• Растения / пищевые материалы: Полифенолы, танины, полисахариды, пигменты. Полифенолы связываются с белками при окислении, а полисахариды увеличивают вязкость и соосаждаются с ДНК.

При работе с ингибиторами традиционное серийное разбавление часто приводит к потере драгоценных низкоконцентрированных целевых матриц. Рекомендуется комбинация следующих практических стратегий:

1. Переключение полимераз как основная мера: Не концентрируйтесь только на «высокоточных» ферментах; отдавайте предпочтение устойчивым к ингибиторам полимеразам. Выбирайте ферменты, устойчивые к крови, для образцов крови и ферменты, устойчивые к гуминовой кислоте, для образцов почвы.

2. Стратегическое использование добавок:

   • БСА (бычий сывороточный альбумин): Эффективно связывает определенные ингибирующие вещества для спасения затронутых полимераз, хотя и не устраняет тушение красителя.

   • T4 gp32 / агенты для удаления гуминовой кислоты: Специализированные добавки для удаления ингибиторов могут использоваться для сложных экологических матриц.

3. Корректировка методов детекции: Если SYBR Green постоянно тушится, рассмотрите возможность перехода на гидролизуемые зонды (например, TaqMan), которые, как правило, менее восприимчивы к интерференции флуоресценции матрицы.

4. Сокращение длины ампликона: В системах dPCR и ингибированной qPCR поддерживайте длину ампликона в пределах 70–120 п.н.. Более короткие фрагменты амплифицируются со значительно более высокой эффективностью в неблагоприятных условиях по сравнению с более длинными мишенями.