من المحتمل أن أي شخص يعمل في مجال التشخيص الجزيئي واجه هذه السيناريوهات:أو مستخلصات الطعام تسبب تأخيرًا مفاجئًا لقيمة Cq- تظهر منحنيات التضخيم ولكن مع فلوريسانس ضعيف ، ومع ذلك تظهر نطاقات هدف واضحة على هلام الأغاروز.والنتائج لا تزال غير مستقرة حتى مع منحنى قياسي- يظل التحول إلى الـ dPCR في ظل الاعتقاد بأن "الـ PCR الرقمية محصنة من التثبيط" يؤدي إلى تقسيمات / قطرات غير مضاءة وعدد النسخ المطلق المستهدر.

وراء هذه القضايا، غالبا ما تلعب مثبطات PCR دورا مركزيا.الكيمياء التحليلية والحيوية التحليليةيحدد بشكل منهجي آليات التثبيط عبر qPCR و dPCR و MPS: PCR أكثر تعقيدًا بكثير من مجرد خلط قالب مع خليط رئيس.إنه يعتمد في الوقت نفسه على البوليمرة في المختبر، التسخين المبدئي ، التشويش / إعادة التشويش ، والكشف عن الفلوريسنس. إذا كانت جزيئات معينة في المصفوفة تتداخل مع أي من هذه الخطوات ، فسوف تصبح النتائج مشوهة.

توضح المراجعة ردود الفعل الفرعية الحرجة لـ PCR كسلسلة مستمرة:تعديل الطبيعة للقالب → ربط البريمر بالسلسلة الواحدة → امتداد البوليمراز → تراكم المنتج → الكشف عن الفلوريسنس.

يشير مثبط PCR بشكل عام إلى أي مادة تنبع من مصفوفة العينة أو الخلايا المستهدفة أو عوامل الاستخراج التي تتداخل مع البوليمرزة في المختبر أو إشارات الفلوريسنس.

النقاط المشتركة للتداخل تقع في ثلاث فئات رئيسية:

1. استهداف البوليمراز مباشرةالمثبطون يقللون من نشاط Taq أو غيرها من البوليمرازات الحمض النووي الثابتة الحرارية ، مما يقلل من كفاءة التضخيم العامة. عندما تتأثر الدورات المبكرة ، يتم تأخير Cq ؛ عندما تتأثر في جميع أنحاء ، يتم تقليل التضخم.الضخم قد يفشل بالكاملحمض الهيوميك، الهيموغلوبين، الهيمين، أملاح الصفراء، حمض الفيتيك، والبوليفينول هي المركبات النموذجية التي تضعف نشاط البوليمراز.

2. التدخل مع الأحماض النووية / التسخين الأوليرتبط المثبطون بالحمض النووي ذو السلسلة الواحدة (ssDNA) أو الحمض النووي ذو السلسلة المزدوجة (dsDNA) ، مما يمنع البرايمر من الوصول إلى القالب. وهذا يؤثر بشكل خاص على الدورات الأولية.الغلوبولين المناعي G (IgG) هو مثال كلاسيكي: يرتبط بـ ssDNA الجينومية ويعطل تبرئة البرايمر، مما يؤدي إلى تأخير قيم Cq.

3. تعطل الكشف عن الفلوريسنسهذه المواد قد لا تسبب بالضرورة فشل التضخيم، لكنها تجعل الجهاز "غير قادر على رؤية" الإشارة.حمض الهيوميك والهيموجلوبين يمكن أن تشكل معقدات إطفاء ثابتة مع الأصباغ الحرة، قمع الإشارات من SYBR Green I ، EvaGreen ، ResoLight ، ROX ، وغيرها. يمكن لـ DTT إطفاء الأصباغ المرجعية السلبية في أنظمة معينة. هذا الوضع من التثبيط مخادع للغاية:يحدث التضخم بالفعل (الشركات مرئية على الكهرباء الهلامية)، ولكن منحنى qPCR يظهر تأخيرًا في البدء وانخفاضًا في الهبوط؛ في dPCR ، تؤدي إشارات المرجعية السلبية المكبوتة إلى إعدادات عتبة إيجابية / سلبية غير صحيحة.

الشكل 1تمثيل مخططي لخطوات التفاعل الرئيسية في PCR. يمكن لمثبطي PCR التأثير على أي من هذه الخطوات ، على سبيل المثال ، من خلال التدخل في إعادة تطهير المبتدئين ، والتأثير على نشاط البوليمراز الحمض النووي ،أو يضعف الكشف عن الفلوريسنس.

يعتمد qPCR على قيم Cq (دورة الكمية) والمنحنيات القياسية للكمية المطلقة أو النسبية.يمكن أن يكون التدخل في حركية التضخيم المبكر من قبل المثبطين قاتلاً لدقة البيانات.

1. تشويه الكفاءة:في وجود مثبطات مثل حمض الهيوميك أو أملاح الصفراء البرازية، وميل منحنى التضخيم يتغير،مما يسبب انخفاض الكفاءة المحسوبة خارج النطاق المقبول من 90٪ ٪ 110٪هذا يؤدي إما إلى زيادة أو انخفاض الكمية.

2. القطع الأثرية الفلوريسنتية:إذا فشلت منحنيات التضخيم في الارتفاع بشكل صحيح ولكن الكهرباء الكهربائية الجل الاغاروز تكشف عن منتجات هدف واضحة ، فإن إطفاء الفلوريسانس من المرجح أن يحدث.حمض الهيوميك لا يمنع فقط البوليمرازيز ولكن أيضا يقلل بشكل كبير من شدة الفلوروسانس.

3. إنقاذ عن طريق أجهزة التحكم في التضخم الداخلي (IAC):إن إدخال إشارة IAC إلى نظام qPCR هو استراتيجية فعالة للكشف عن التثبيط. إذا تأخر كل من إشارة IAC وإشارة الهدف في نفس الوقت،أنه يؤكد وجود مثبطات المصفوفة بدلا من مشكلة مع تسلسل الهدف نفسه.

الشكل 2.أمثلة على تثبيط PCR في qPCRأ.منحنيات التضخيم التي تم الحصول عليها مع زيادة كميات حمض الفولفيك، الذي يمنع التضخيم.ب.إلكتروفوريز الجل الاغاروزي المقابلة لردود الفعل التضخمية فيأ.ج.منحنيات التضخيم التي تم الحصول عليها مع زيادة كميات حمض الهيوميك ، الذي يطفئ الفلوريسنس.د.إلكتروفوريز الجل الاغاروزي المقابلة لردود الفعل التضخمية فيجالرقم في الرسومات يمثل كمية حمض الهيوميك أو الفولفيك المضافة إلى خليط التفاعل. يشير PC (السيطرة الإيجابية) إلى تفاعل تم فيه استبدال مثبط PCR بالماء.تم الكشف عن ذلك باستخدام صبغة EvaGreen.

من خلال تقسيم خليط التفاعل إلى عشرات الآلاف من القطرات أو الغرف الدقيقة لقراءة النقطة النهائية ، لا يعتمد dPCR على قيم Cq.تحمله للاعتراض الخفيف هو في الواقع أفضل من qPCRومع ذلك، تؤكد المراجعة صراحة أن الـ dPCR ليست علاجًا عالميًا.

1. حدود تخفيف التقسيم:في حين أن تقسيم يقلل من تركيز مثبط داخل المقصورات الدقيقة الفردية ، يمكن أن يؤدي التثبيط القوي إلى فشل التضخيم في بعض القطرات ،مما يؤدي إلى انخفاض معدل الإيجابية وتخفيض عدد النسخ المطلقة.

2. الاختلافات الجوهرية بين البوليمرازات:البوليمرازات تختلف بشكل كبير في تحملها للمثبطات.وتلاحظ المراجعة أن التحول إلى البوليمرازات المحددة المقاومة للمثبط أو المكافئات المُحسّنة يمكن أن يزيد من تحمل dPCR لحمض الهيوميك بمقدار عشرة أضعاف.

3. قمع إشارات المرجعية السلبية:يعتمد dPCR على عتبات الفلوروسانس للتمييز بين الحوائط الإيجابية والسلبية. إذا كان الهيموغلوبين أو حمض الهيوميك في العينة يطفئ الأصباغ المرجعية السلبية مثل ROX،فشل في تطبيع الحد، مما يؤدي إلى سلبيات كاذبة حيث يتم تصنيف الإيجابيات الضعيفة بشكل خاطئ.

• البيئة التربة / المياهحمض الهيوميك، حمض الفولفيك، يعملون عن طريق آليات مزدوجة، كلاهما يمنع البوليمرازات ويمحو فلوريسانس SYBR / EvaGreen.

• الدم / البلازماالهيموغلوبين، الهيمين، IgG. الهيموغلوبين يسمم مباشرة البوليمرازات ويمحو الصبغات، في حين أن IgG تعمل كـ "غراء" يرتبط بالحمض النووي ويمنع تبرئة البرايمر.

• البراز / عينات الأمعاء:أملاح الصفراء، حمض الفيتيك، السكريات الكبيرة، إنها تمنع بشكل رئيسي نشاط البوليمراز، مما يؤدي إلى انخفاض كفاءة التضخيم.

• النباتات / المواد الغذائية:البوليفينول، التانين، البوليساكريدات، الصبغات. البوليفينول يربط البروتينات عند الأكسدة، في حين أن البوليساكريدات تزيد من اللزوجة وتسقط مع الحمض النووي.

عندما يتعلق الأمر بالمثبطين ، غالبًا ما يفقد التخفيف التسلسلي التقليدي قوالب الهدف الثمينة منخفضة الكثافة. يوصى بمزيج من الاستراتيجيات العملية التالية:

1. تغيير البوليمرازات كإجراء أساسي:لا تركز فقط على الإنزيمات "المتميزة"المقاومة للمثبطالبوليمرازات: اختر إنزيمات تتسامح مع الدم لعينات الدم وأنزيمات تتسامح مع حمض الهيوميك لعينات التربة البيئية.

2. الاستخدام الاستراتيجي للمواد المضافة:

   • BSA (البومين في مصل البقر):يربط بعض المواد المثبطة بفعالية لإنقاذ البوليمرازات المصابة ، على الرغم من أنه لا يحل إطفاء الصبغة.

   • T4 gp32 / وكلاء إزالة الحوم:يمكن استخدام إضافات إزالة مثبطات متخصصة للمصفوفات البيئية المعقدة.

3. تعديل أساليب الكشف:إذا تم إطفاء SYBR Green باستمرار ، فكر في التبديل إلى مسبار هيدروليز (على سبيل المثال ، TaqMan) ، والذي يكون أقل عرضة للتداخلات الفلوريسنتية للمصفوفة.

4. إختصار طول المضخة:في أنظمة dPCR و qPCR المثبطة، الحفاظ على أطوال الأمبليكونات ضمن70 ≈ 120 نقطة.تضخم الشظايا القصيرة بكفاءة أعلى بكثير في ظل ظروف غير مواتية مقارنة بالأهداف الطويلة.