Китай JLM-Lifetech последняя компания Блог около Анализатор взаимодействия FCS помогает команде Фуцзяньского медицинского университета открыть лекарство от маломолекулярного АД

Журнал: Pharmacological Research

Исследовательская группа: Команда Сяочунь Чен / Фэйшэн Чжун / Зучэн Е, Фуцзяньский медицинский университет

DOI: https://doi.org/10.1016/j.phrs.2025.107834

01 Обзор исследований

Галектин-3 (Gal-3) — ключевой белок, регулирующий нейровоспалительные процессы, и играет важную роль в патологическом течении болезни Альцгеймера (БА), что делает его весьма перспективной терапевтической мишенью. Однако разработка низкомолекулярных ингибиторов, которые могут эффективно подавлять активность Gal-3, обладая при этом высокой проницаемостью через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), остается серьезной проблемой в данной области.

Исследовательская группа под руководством Сяочунь Чен, Фэйшэн Чжун и Зучэн Е из Фуцзяньского медицинского университета опубликовала исследование под названием "ИИ-ориентированный поиск проникающих через ГЭБ ингибиторов галектина-3 для терапии болезни Альцгеймера" в авторитетном фармакологическом журнале Pharmacological Research (IF = 10,5). Используя платформу скрининга лекарств с поддержкой ИИ, исследование успешно идентифицировало FJMU1887, низкомолекулярное соединение с потенциальной терапевтической ценностью, и подтвердило его прямое связывание с Gal-3 в последующих экспериментах. Механистические исследования показали, что FJMU1887 обратимо связывается с Gal-3, нарушая взаимодействие между Gal-3 и TREM2 (рецептор триггерной экспрессии на миелоидных клетках 2). Дальнейшие in vitro противовоспалительные анализы, фармакокинетический анализ и in vivo оценки эффективности в совокупности продемонстрировали, что FJMU1887 является проникающим через ГЭБ низкомолекулярным ингибитором Gal-3 с двойным действием: подавлением нейровоспаления и улучшением когнитивных функций. В целом, FJMU1887 представляет собой первый пероральный ингибитор Gal-3 с благоприятной проницаемостью через ГЭБ, обладающий как противонейровоспалительным, так и когнитивно-улучшающим действием, что обеспечивает перспективное лидирующее соединение для терапии БА, одновременно подтверждая осуществимость стратегий открытия лекарств с помощью ИИ.

02 Исследование влияния низкомолекулярных соединений на динамику белковых комплексов с помощью КСП

TREM2 — это рецептор, специфичный для микроглии, участвующий в модуляции нейровоспалительных реакций и фагоцитоза микроглии при БА. Недавние исследования показали, что Gal-3 взаимодействует с TREM2, тем самым влияя на состояния активации микроглии и связанные с ними сигнальные пути воспаления.

В данном исследовании авторы сначала подтвердили связывающую активность FJMU1887 с Gal-3 с использованием традиционных методов анализа взаимодействия, включая биослойную интерферометрию (BLI) и микромасштабную термофорез (MST), получив константу диссоциации ( $K_d$ ) $1.55\ \mu\text{M}$ . Для дальнейшего изучения специфического влияния FJMU1887 на опосредованные Gal-3 белковые взаимодействия команда применила спектроскопию флуоресцентной корреляции (КСП) для мониторинга динамического образования и диссоциации комплекса Gal-3/TREM2 in situ в живых клетках.

В экспериментальной установке Gal-3 и TREM2, меченные флуоресцентными белками moxCerulean3 и mGold соответственно, были ко-трансфицированы в клетки HEK293. После конфокальной визуализации КСП проводилась в областях флуоресцентной колокализации для измерения коэффициента диффузии ( $D$ ) TREM2-mGold, непрерывно отслеживая динамические изменения во время обработки соединениями и их вымывания (Рисунок A). Результаты показали, что FJMU1887 нарушал взаимодействие между Gal-3 и растворимым TREM2 (sTREM2), приводя к значительному увеличению внутриклеточного коэффициента диффузии sTREM2. После вымывания соединения Gal-3 повторно связывался с sTREM2, и коэффициент диффузии возвращался к исходному уровню. Это указывало на то, что обратимое связывание FJMU1887 с Gal-3 динамически модулирует взаимодействие Gal-3/TREM2. Этот вывод был далее подтвержден экспериментами по переносу флуоресцентной энергии (FRET), предоставляя дополнительное свидетельство того, что FJMU1887 влияет на образование или стабильность комплекса Gal-3/TREM2. Динамическое равновесие этого комплекса играет важную роль в регуляции нейровоспаления, связанного с БА.

Рисунок. Нарушение образования комплекса Gal-3/TREM2 с помощью FJMU1887, оцененное с помощью КСП. Коэффициент диффузии (D $D$ 10 мкМ $10\ \mu\text{M}$ P < 0,001 $P < 0.001$ КСП не только успешно зафиксировала нарушение динамики белковых комплексов под действием препарата, но и четко выявила полную цепочку механизма:

обратимое связывание

→ диссоциация комплекса $\rightarrow$ функциональное ингибирование. Это подчеркивает уникальную ценность КСП в изучении взаимодействий белок-белок в живых клетках и низкомолекулярных регуляторных механизмов in situ:

Динамический мониторинг в реальном времени: Мониторит процессы в нативных клеточных микросредах без необходимости установления пороговых значений фиксированного межмолекулярного расстояния. Любое изменение гидродинамического радиуса или конформации, возникающее в результате связывания, может быть обнаружено путем сдвигов в коэффициенте диффузии.
Определение равновесия in situ: Измеряет непосредственно в условиях равновесия связывания-диссоциации в растворе или живых клетках без этапов промывки, достигая чувствительности на уровне одиночных молекул.
Количественный кинетический анализ: Выдает коэффициенты диффузии в виде непрерывных количественных метрик, в отличие от традиционных конечных или качественных анализов. В сочетании с экспериментами по вымыванию он напрямую доказывает обратимость ингибирования соединения, предоставляя количественные данные для оценки эффективности и механизма действия.

Благодаря этим преимуществам КСП обеспечила динамическое наблюдение в реальном времени за обратимым ингибированием взаимодействия Gal-3/TREM2 с помощью FJMU1887 — аспект, труднодоступный с помощью традиционных биохимических методов.

04 Значение исследований и будущие перспективы КСП

В данном исследовании успешно использовался скрининг лекарств с помощью ИИ для идентификации лидирующего соединения FJMU1887 из большой химической библиотеки. Комбинируя несколько ортогональных методов — анализ аффинности (BLI/MST), измерение межмолекулярного расстояния (FRET) и мониторинг динамики взаимодействия белков (КСП) — команда систематически расшифровала механизм действия с различных точек зрения. Обширные in vitro и in vivo оценки подтвердили, что FJMU1887 обладает двойной противонейровоспалительной и когнитивно-улучшающей активностью, что подтверждает его потенциал в качестве терапевтического кандидата при БА.

На этой интегрированной платформе КСП предоставила критические данные о динамической диффузии в живых клетках, недоступные другими методами, доказав, что FJMU1887 обратимо нарушает связывание Gal-3/TREM2. Это обеспечило прямое доказательство для выяснения механизма действия препарата и дополнительное подтверждение прямого взаимодействия между Gal-3 и TREM2. Исследование демонстрирует основные преимущества КСП: мониторинг динамики комплексов в растворе в реальном времени, масочное измерение без привязки и прямой количественный вывод коэффициентов диффузии.

О технологии КСП

Спектроскопия флуоресцентной корреляции (КСП) количественно измеряет такие параметры, как молярная концентрация, яркость флуоресценции/состояние агрегации, коэффициент диффузии/гидродинамический радиус и аффинность связывания ( $K_D$ ) с разрешением на уровне одиночных молекул в микрообъемных (несколько микролитров) растворных образцах или отдельных живых клетках. Совместимая с физиологическими образцами (например, лизатами клеток, кровью), она является in situ, гомогенным, высококонтентным аналитическим инструментом. КСП и ее производные методы широко применяются в изучении передачи сигналов, жидкостно-жидкостного разделения фаз, агрегации биомолекул, структурно-функциональных механизмов, разработке наномедицины, характеристике экзосом, разработке флуоресцентных зондов, скрининге антител/лекарств и микрофлюидике, с более чем 15 000 исследовательских статей, проиндексированных в PubMed.

О анализаторе молекулярных взаимодействий КСП JLM-Lifetech

Анализатор взаимодействия FCS помогает команде Фуцзяньского медицинского университета открыть лекарство от маломолекулярного АД

Анализатор молекулярных взаимодействий КСП серии MIA для кинетики одиночных молекул представляет собой высокочувствительную аналитическую платформу на основе технологии КСП. Обнаруживая флуктуационные сигналы флуоресценции в чрезвычайно малых объемах наблюдения, он позволяет проводить анализ молекулярных взаимодействий и характеристик на уровне одиночных молекул. Используя корреляционные алгоритмы для анализа сигналов во временной области, система работает без этапов разделения или очистки (гомогенный анализ). Всего с десятками микролитров образца он обеспечивает высокопроизводительный количественный анализ концентрации, размера частиц, коэффициента диффузии и аффинности связывания ( $K_d$ ) за секунды.