Analisador de Interação FCS Ajuda Equipe da Fujian Medical University a Descobrir Medicamento de Molécula Pequena para DA

Revista: Pharmacological Research

Equipe de Pesquisa: Equipe Xiaochun Chen / Feisheng Zhong / Zucheng Ye, Fujian Medical University

DOI: https://doi.org/10.1016/j.phrs.2025.107834

01 Visão Geral da Pesquisa

A Galectina-3 (Gal-3) é uma proteína chave que regula processos neuroinflamatórios e desempenha um papel crucial na progressão patológica da doença de Alzheimer (DA), tornando-a um alvo terapêutico muito promissor. No entanto, o desenvolvimento de inibidores de molécula pequena que possam inibir eficientemente a atividade da Gal-3, ao mesmo tempo que possuem forte permeabilidade da barreira hematoencefálica (BHE), continua a ser um grande desafio na área.

A equipe de pesquisa liderada por Xiaochun Chen, Feisheng Zhong e Zucheng Ye na Fujian Medical University publicou um estudo intitulado "Descoberta impulsionada por IA de inibidores de Galectina-3 penetrantes no cérebro para terapia da doença de Alzheimer" na revista de farmacologia autoritária Pharmacological Research (FI = 10,5). Usando uma plataforma de triagem de medicamentos assistida por IA, o estudo identificou com sucesso o FJMU1887, um composto de molécula pequena com potencial valor terapêutico, e verificou sua interação de ligação direta com a Gal-3 por meio de experimentos subsequentes. Estudos mecanísticos mostraram que o FJMU1887 se liga reversivelmente à Gal-3, interferindo na interação entre a Gal-3 e o TREM2 (Receptor de Gatilho Expresso em Células Mieloides 2). Ensaios anti-inflamatórios e adicionais, análise farmacocinética e avaliações de eficácia confirmaram que o FJMU1887 possui atividades anti-neuroinflamatórias e de aprimoramento cognitivo duplas, estabelecendo seu potencial como candidato terapêutico para DA. demonstraram coletivamente que o FJMU1887 é um inibidor de Gal-3 de molécula pequena permeável à BHE com efeitos duplos: inibição da neuroinflamação e melhora da função cognitiva. No geral, o FJMU1887 representa o primeiro inibidor oral de Gal-3 com permeabilidade cerebral favorável que exibe efeitos anti-neuroinflamatórios e de aprimoramento cognitivo, fornecendo um composto líder promissor para a terapia da DA, ao mesmo tempo que valida a viabilidade de estratégias de descoberta de medicamentos assistidas por IA.

02 Investigando Efeitos de Moléculas Pequenas na Dinâmica de Complexos Proteicos via FCS

O TREM2 é um receptor específico de micróglias envolvido na modulação das respostas neuroinflamatórias e na fagocitose microglial na DA. Estudos recentes mostraram que a Gal-3 interage com o TREM2, influenciando assim os estados de ativação microglial e as vias de sinalização inflamatória associadas.

Neste estudo, os autores primeiro confirmaram a atividade de ligação do FJMU1887 à Gal-3 usando métodos convencionais de ensaio de interação, incluindo Interferometria de Bio-Camada (BLI) e Termoforese em Microescala (MST), obtendo uma constante de dissociação () em segundos.) de 1,55μM. Para explorar ainda mais o impacto específico do FJMU1887 nas interações proteicas mediadas pela Gal-3, a equipe empregou Espectroscopia de Correlação de Fluorescência (FCS) para monitorar a formação e dissociação dinâmica do complexo Gal-3/TREM2 , homogênea e de alto conteúdo. O FCS e seus métodos derivados têm sido amplamente aplicados em transdução de sinal, separação de fase líquido-líquido, agregação biomolecular, mecanismos estruturais-funcionais, desenvolvimento de nanomedicina, caracterização de exosomos, desenvolvimento de sondas fluorescentes, triagem de anticorpos/medicamentos e microfluídica, com mais de 15.000 artigos de pesquisa indexados no PubMed. dentro de células vivas.

No experimento, Gal-3 e TREM2 marcados com as proteínas fluorescentes moxCerulean3 e mGold, respectivamente, foram co-transfectados em células HEK293. Após imagem confocal, FCS foi realizado em regiões de colocalização de fluorescência para medir o coeficiente de difusão () do complexo Gal-3–TREM2 foi medido sob diferentes condições. O tratamento com ) do TREM2-mGold, monitorando continuamente as mudanças dinâmicas durante o tratamento com o composto e a lavagem (Figura A). Os resultados mostraram que o FJMU1887 interrompeu a interação entre a Gal-3 e o TREM2 solúvel (sTREM2), levando a um aumento significativo no coeficiente de difusão intracelular do sTREM2. Após a lavagem do composto, a Gal-3 se ligou novamente ao sTREM2 e o coeficiente de difusão retornou ao nível basal. Isso indicou que a ligação reversível do FJMU1887 à Gal-3 modula dinamicamente a interação Gal-3/TREM2. Essa conclusão foi ainda validada por experimentos de Transferência de Ressonância de Energia de Fluorescência (FRET), fornecendo evidências complementares de que o FJMU1887 afeta a formação ou estabilidade do complexo Gal-3/TREM2. O equilíbrio dinâmico deste complexo desempenha um papel importante na regulação da neuroinflamação associada à DA.

Figura. Interrupção da formação do complexo Gal-3/TREM2 pelo FJMU1887 avaliada via FCS. O coeficiente de difusão (D) do complexo Gal-3–TREM2 foi medido sob diferentes condições. O tratamento com 10μM de FJMU1887 aumentou significativamente o coeficiente de difusão em comparação com o complexo não tratado (***P < 0,001), indicando interrupção do complexo. Notavelmente, o efeito do FJMU1887 foi reversível—após a lavagem, o coeficiente de difusão se recuperou em grande parte aos níveis basais, demonstrando a reforma do complexo. Pontos de dados individuais representam medições únicas; barras indicam média ±SEM. A significância estatística foi determinada usando ANOVA de uma via seguida pelo teste post-hoc de Tukey.03 Vantagens Tecnológicas Chave do FCS

O FCS não apenas capturou com sucesso a interrupção da dinâmica do complexo proteico pelo medicamento, mas também revelou claramente a cadeia completa do mecanismo:

ligação reversível → dissociação do complexo → inibição funcional. Isso destaca o valor único do FCS no estudo de interações proteína-proteína em células vivas e mecanismos regulatórios de moléculas pequenas in situ, homogênea e de alto conteúdo. O FCS e seus métodos derivados têm sido amplamente aplicados em transdução de sinal, separação de fase líquido-líquido, agregação biomolecular, mecanismos estruturais-funcionais, desenvolvimento de nanomedicina, caracterização de exosomos, desenvolvimento de sondas fluorescentes, triagem de anticorpos/medicamentos e microfluídica, com mais de 15.000 artigos de pesquisa indexados no PubMed.Monitoramento Dinâmico em Tempo Real:

• Monitora processos em ambientes celulares nativos sem exigir limiares fixos de distância intermolecular. Qualquer mudança no raio hidrodinâmico ou conformação resultante da ligação pode ser detectada por meio de desvios no coeficiente de difusão.Detecção de Equilíbrio In-Situ:

• Mede diretamente sob condições de equilíbrio de ligação-dissociação em solução ou células vivas sem etapas de lavagem, atingindo sensibilidade de molécula única.Análise Cinética Quantitativa:

• Produz coeficientes de difusão como métricas quantitativas contínuas, ao contrário de ensaios convencionais de ponto final ou qualitativos. Combinado com experimentos de lavagem, prova diretamente a reversibilidade da inibição do composto, fornecendo dados quantitativos para avaliações de eficácia e mecanismo.Através dessas vantagens, o FCS alcançou a observação dinâmica em tempo real da inibição reversível do FJMU1887 da interação Gal-3/TREM2—uma dimensão difícil de acessar por meio de técnicas bioquímicas tradicionais.

04 Significado da Pesquisa e Perspectivas Futuras para o FCS

Este estudo utilizou com sucesso a triagem de medicamentos assistida por IA para identificar o composto líder FJMU1887 a partir de uma grande biblioteca química. Ao combinar múltiplas técnicas ortogonais—análise de afinidade (BLI/MST), medição de distância intermolecular (FRET) e monitoramento dinâmico de interação proteica (FCS)—a equipe decodificou sistematicamente o mecanismo de ação de múltiplas perspectivas. Avaliações extensas

in vitro e in vivo confirmaram que o FJMU1887 possui atividades anti-neuroinflamatórias e de aprimoramento cognitivo duplas, estabelecendo seu potencial como candidato terapêutico para DA.Nesta plataforma integrada, o FCS forneceu dados dinâmicos críticos de difusão em células vivas, inatingíveis por outros métodos, provando que o FJMU1887 interrompe reversivelmente a ligação Gal-3/TREM2. Isso ofereceu evidências diretas para elucidar o mecanismo do medicamento e forneceu validação adicional da interação direta entre Gal-3 e TREM2. O estudo demonstra as vantagens centrais do FCS: monitoramento em tempo real da dinâmica de complexos em solução, medição sem máscara e não ligada, e saída quantitativa direta de coeficientes de difusão.

Sobre a Tecnologia FCS

A Espectroscopia de Correlação de Fluorescência (FCS) mede quantitativamente parâmetros como concentração molar, brilho/estado de agregação de fluorescência, coeficiente de difusão/raio hidrodinâmico e afinidade de ligação (

KD) com resolução de molécula única em amostras de solução de microvolume (alguns microlitros) ou células vivas individuais. Compatível com amostras fisiológicas (por exemplo, lisados celulares, sangue), é uma ferramenta analítica in situ, homogênea e de alto conteúdo. O FCS e seus métodos derivados têm sido amplamente aplicados em transdução de sinal, separação de fase líquido-líquido, agregação biomolecular, mecanismos estruturais-funcionais, desenvolvimento de nanomedicina, caracterização de exosomos, desenvolvimento de sondas fluorescentes, triagem de anticorpos/medicamentos e microfluídica, com mais de 15.000 artigos de pesquisa indexados no PubMed.Sobre o Analisador de Interação FCS JLM-Lifetech

O 

Analisador Molecular de Interação FCS da série MIA para Cinética de Molécula Única é uma plataforma de análise de alta sensibilidade baseada na tecnologia FCS. Ao detectar sinais de flutuação de fluorescência em volumes de observação extremamente pequenos, ele permite a análise de interação e caracterização biomolecular de molécula única. Usando algoritmos de correlação para analisar sinais no domínio do tempo, o sistema opera sem etapas de separação ou purificação (ensaio homogêneo). Com apenas dezenas de microlitros de amostra, ele fornece análise quantitativa de alto rendimento de concentração, tamanho de partícula, coeficiente de difusão e afinidade de ligação (Kd) em segundos.