FCSインタラクションアナライザーが福建医科大学チームによる低分子AD薬発見を支援
ジャーナル: 本研究では、著者らはまず、Bio-Layer Interferometry（BLI）およびMicroScale Thermophoresis（MST）を含む従来の相互作用アッセイ法を用いてFJMU1887のGal-3への結合活性を確認し、解離定数（Kd）を1.55μMとしました。FJMU1887がGal-3媒介タンパク質相互作用に及ぼす特異的な影響をさらに探求するため、チームは蛍光相関分光法（FCS）を用いて、生細胞内でのGal-3/TREM2複合体の動的な形成と解離をin situでモニタリングしました。
研究チーム: 夏小春 陳 / 飛生 鐘 / 祖成 葉 チーム、福建医科大学
DOI: https://doi.org/10.1016/j.phrs.2025.107834
01 研究概要
ガラクトース-3（Gal-3）は、神経炎症プロセスを調節する主要なタンパク質であり、アルツハイマー病（AD）の病理学的進行において重要な役割を果たしており、非常に有望な治療標的となっています。しかし、Gal-3の活性を効率的に阻害し、かつ強力な血液脳関門（BBB）透過性を有する低分子阻害剤の開発は、この分野における大きな課題です。
夏小春 陳、飛生 鐘、祖成 葉が率いる福建医科大学の研究チームは、「アルツハイマー病治療のための脳透過性ガラクトース-3阻害剤のAI駆動型発見」と題された研究を、権威ある薬理学ジャーナル「ファーマコロジカル・リサーチ」（IF = 10.5）に発表しました。AI支援型創薬スクリーニングプラットフォームを使用して、研究では治療価値の可能性を秘めた低分子化合物FJMU1887を成功裏に特定し、その後の実験でGal-3との直接的な結合相互作用を検証しました。メカニズム研究では、FJMU1887がGal-3に可逆的に結合し、Gal-3とTREM2（ミエロイド細胞2型受容体トリガー）との相互作用を妨害することが示されました。さらに、in vitroでの抗炎症アッセイ、薬物動態解析、およびin vivoでの有効性評価は、FJMU1887が神経炎症を阻害し認知機能を改善するという二重の効果を持つ、BBB透過性の低分子Gal-3阻害剤であることを総合的に示しました。全体として、FJMU1887は、抗神経炎症作用と認知機能向上作用の両方を示す、良好な脳透過性を持つ最初の経口Gal-3阻害剤であり、AD治療のための有望なリード化合物を提供すると同時に、AI支援型創薬戦略の実現可能性を検証しています。02 FCSによるタンパク質複合体ダイナミクスへの低分子効果の調査TREM2は、ADにおける神経炎症応答およびミクログリア食作用の調節に関与するミクログリア特異的受容体です。最近の研究では、Gal-3がTREM2と相互作用し、それによってミクログリアの活性化状態および関連する炎症シグナル伝達経路に影響を与えることが示されています。本研究では、著者らはまず、Bio-Layer Interferometry（BLI）およびMicroScale Thermophoresis（MST）を含む従来の相互作用アッセイ法を用いてFJMU1887のGal-3への結合活性を確認し、解離定数（Kd）を1.55μMとしました。FJMU1887がGal-3媒介タンパク質相互作用に及ぼす特異的な影響をさらに探求するため、チームは蛍光相関分光法（FCS）を用いて、生細胞内でのGal-3/TREM2複合体の動的な形成と解離をin situでモニタリングしました。実験設定では、それぞれ蛍光タンパク質moxCerulean3およびmGoldで標識されたGal-3とTREM2をHEK293細胞に共導入しました。共焦点イメージングの後、蛍光共局在領域でFCSを実施し、化合物処理中および洗浄中の動的な変化を連続的にモニタリングするためにTREM2-mGoldの拡散係数（D）を測定しました（図A）。結果は、FJMU1887がGal-3と可溶性TREM2（sTREM2）との相互作用を破壊し、sTREM2の細胞内拡散係数の有意な増加につながることを示しました。化合物を洗浄すると、Gal-3はsTREM2に再結合し、拡散係数はベースラインに戻りました。これは、FJMU1887がGal-3に可逆的に結合することでGal-3/TREM2相互作用を動的に調節することを示唆しています。この結論は、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）実験によってさらに検証され、FJMU1887がGal-3/TREM2複合体の形成または安定性に影響を与えるという補完的な証拠を提供しました。この複合体の動的平衡は、AD関連神経炎症の調節において重要な役割を果たします。03 FCSの主要な技術的利点リアルタイム動的モニタリング：固定された分子間距離閾値を必要とせず、ネイティブ細胞微小環境でのプロセスをモニタリングします。結合によって生じる流体力学的半径または構造の変化は、拡散係数のシフトによって検出できます。
in situ平衡検出：単一分子感度に達し、洗浄ステップなしで、溶液または生細胞中の結合-解離平衡条件下で直接測定します。
定量的運動解析：従来の終点または定性アッセイとは異なり、連続的な定量的指標として拡散係数を出力します。洗浄実験と組み合わせることで、化合物の阻害の可逆性を直接証明し、有効性とメカニズム評価のための定量的データを提供します。
これらの利点を通じて、FCSは、従来の生化学的手法ではアクセスが困難な次元である、FJMU1887によるGal-3/TREM2相互作用の可逆的阻害のリアルタイム動的観測を達成しました。本研究では、AI支援型創薬スクリーニングを効果的に活用して、大規模な化学ライブラリからリード化合物FJMU1887を特定しました。複数の直交技術（親和性解析（BLI/MST）、分子間距離測定（FRET）、タンパク質相互作用動的モニタリング（FCS））を組み合わせることで、チームは複数の視点から作用機序を体系的に解読しました。広範なin vitroおよびin vivo評価により、FJMU1887が二重の抗神経炎症作用と認知機能向上作用を有することが確認され、AD治療候補としての可能性が確立されました。この統合プラットフォームにおいて、FCSは他の方法では得られない重要な生細胞動的拡散データを提供し、FJMU1887がGal-3/TREM2結合を可逆的に破壊することを示しました。これは、薬剤のメカニズム解明のための直接的な証拠を提供し、Gal-3とTREM2の直接的な相互作用の追加検証を提供しました。本研究は、FCSのコアな利点である、溶液中の複合体ダイナミクスのリアルタイムモニタリング、マスクレス非固定測定、および拡散係数の直接定量出力を示しています。FCS技術についてJLM-Lifetech FCS相互作用アナライザーについて
MIAシリーズFCS分子相互作用アナライザー（単一分子運動学用）は、FCS技術に基づいた高感度分析プラットフォームです。極めて小さな観察体積での蛍光変動信号を検出することにより、単一分子生体分子相互作用および特性評価分析を可能にします。時間領域信号を分析するための相関アルゴリズムを使用して、システムは分離または精製ステップなし（均一アッセイ）で動作します。わずか数十マイクロリットルのサンプルで、数秒で濃度、粒子サイズ、拡散係数、および結合親和性（Kd）の高スループット定量分析を提供します。
