L'analyseur mono-moléculaire FCS aide l'équipe de l'IGDB à révéler la dynamique de la polymérisation du xylane

Le xylane est le deuxième polysaccharide le plus abondant dans les parois cellulaires végétales après la cellulose et joue un rôle essentiel dans le maintien de l'intégrité de la paroi cellulaire, de la résistance mécanique et de la récalcitrance de la biomasse. Sa biosynthèse repose sur un complexe multi-enzymatique appelé complexe xylane synthase (XSC). Cependant, les composants essentiels et les mécanismes biochimiques de la XSC restent largement inconnus. Récemment, une équipe de recherche dirigée par Baocai Zhang duInstitut de génétique et de biologie du développement, Académie chinoise des sciences (IGDB, CAS)a publié une étude dansLa cellule végétaleintituléXYLAN O-ACETYLTRANSFERASE 6 favorise la synthèse du xylane en formant un complexe avec IRX10 et régit la formation des parois du riz.

Cette étude a identifiéXYLANE O-ACÉTYLTRANSFÉRASE 6 (XOAT6)etIRX10 (une xylane synthase)en tant que composants centraux des XSC, formant le module de base fonctionnel du complexe. Les résultats ont démontré que XOAT6 non seulement acétyle le squelette du xylane, mais améliore également directement l’activité polymérase de l’IRX10. Ensemble, ils synthétisent de manière coordonnée et efficace du xylane acétylé. Pour la première fois au niveau moléculaire, ces travaux révèlent les mécanismes sous-jacents à la chaîne du xylaneélongationetmodification, fournissant une base théorique pour l'ingénierie des parois cellulaires, la sélection de cultures à haut rendement et de haute qualité et le développement d'une énergie de biomasse efficace.

L'étude a émis l'hypothèse que XOAT6 agit non seulement comme une acétyltransférase, mais favorise également directement la polymérisation du squelette (élongation) du xylane en formant un complexe avec IRX10. Pour tester cela,Spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS)a été utilisé pour surveiller les changements cinétiques en temps réel pendant la polymérisation, dans le but d'explorer si et comment XOAT6 influence l'activité de la polymérase IRX10 dans des conditions de solution quasi physiologiques.

En tant que glycosyltransférase, IRX10 fonctionne en ajoutant de nouvelles unités xylosyle (donneur) à l'extrémité d'une chaîne xylane existante (accepteur). Dans cette étude,xylobiose (X2)a été utilisé comme accepteur initial, etUDP-xylosecomme substrat donneur.

X2 a été marqué avec le colorant fluorescentAlexa Fluor 488(Figure 4B). Le rayon hydrodynamique (RH) des molécules marquées par fluorescence a été mesuré via une fonction d'autocorrélation pour un suivi dynamique, reflétant l'allongement de la chaîne du xylane en temps réel.

• Groupes de contrôle: Libellé X2 + donneur uniquement ; ou marqué X2 + enzyme (sans donneur).
• Groupes expérimentaux: IRX10 + donneur + marqué X2 IRX10 + XOAT6 + donneur + marqué X2

• XOAT6 favorise fortement la polymérisation: Lorsque IRX10 et XOAT6 étaient présents, le changement de RH était beaucoup plus significatif qu'avec IRX10 seul, indiquant que XOAT6 améliore l'activité polymérase d'IRX10 (Figure 4C).
• Les changements d'humidité relative proviennent de la polymérisation: Les expériences de contrôle n'ont montré aucun changement d'HR lorsque les réactions contenaient uniquement un substrat donneur (UDP-Xyl) et du X2 marqué par AF488, ou uniquement une enzyme et du X2 marqué sans donneur (Figure 4C). Cela confirme que les changements d'HR résultent spécifiquement de la polymérisation de l'UDP-Xyl sur du X2 marqué par AF488.
• Surveillance en temps réel de la polymérisation du xylane: Des mesures continues ont en outre révélé que le taux d'augmentation de l'HR doublait environ lorsque IRX10 et XOAT6 agissaient ensemble, prouvant directement leur promotion synergique de l'allongement de la chaîne du xylane et leur efficacité de polymérisation nettement améliorée au niveau moléculaire (Figure 4D).

Figure 4Validation des interactions moléculaires entre XOAT6, IRX10 et leurs substrats. (A) Test MST : affinité de liaison (Kd) de XOAT6 et de ses mutants à IRX10 marqué. (B – D) Tests FCS : le xylobiose marqué par AF488 a été utilisé pour surveiller les modifications de l'humidité relative en temps réel, reflétant l'allongement de la chaîne du xylane.

Dans cette étude, la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) a été utilisée pour observer les changements dynamiques au cours de la polymérisation du xylane en temps réel.niveau d'une seule molécule, montrant des atouts évidents, en particulier dans la caractérisation de la manière dont le complexe IRX10 – XOAT6 favorise l'allongement de la chaîne du xylane :

• Surveillance dynamique en temps réel d'une seule molécule: FCS détecte le comportement de diffusion de molécules individuelles marquées par fluorescence à des concentrations ultra-faibles (pM – nM), permettant un suivi en temps réel des changements de rayon hydrodynamique pendant la polymérisation. En revanche, les méthodes traditionnelles telles que la spectrométrie de masse et l’électrophorèse analysent uniquement les produits finaux et ne peuvent pas fournir de données dynamiques résolues dans le temps.
• Détection native en solution: Les tests sont effectués en solution homogène dans des conditions quasi physiologiques, sans immobilisation de l'échantillon ni perturbation des conformations des protéines natives. La microscopie électronique et la RMN nécessitent une fixation ou un séchage, ce qui peut altérer l'état natif des complexes protéiques.

Cette étude révèle, pour la première fois, le rôle central du complexe IRX10 – XOAT6 dans la biosynthèse du xylane du riz. Il explique systématiquement comment ce complexe affecte la croissance, le développement et les propriétés de la biomasse des plantes grâce à une catalyse coordonnée et à une régulation structurelle à travers le mécanisme moléculaire, l'architecture de la paroi cellulaire et la biomécanique. Ces résultats fournissent une base théorique importante et un soutien technique pour l’amélioration génétique des cultures, l’utilisation efficace de la biomasse et la biologie des parois cellulaires végétales.

Le FCS a été appliqué pour la première fois à la biosynthèse des polysaccharides de la paroi cellulaire végétale, surmontant ainsi les limites des méthodes conventionnelles. Il permetvisualisation et quantification dynamiques d'une seule molécule en temps réeld'interactions biomoléculaires et de réactions enzymatiques en solution dans des conditions quasi physiologiques, établissant un nouveau paradigme pour l'étude des mécanismes de synthèse de ces macromolécules. En tant que technique puissante de surveillance en temps réel de la dynamique biomoléculaire au niveau d'une molécule unique en solution, la FCS est très prometteuse, en particulier pour les processus biologiques dynamiques, le développement de médicaments et la nanotechnologie, et devrait faire passer la recherche en sciences de la vie de l'analyse structurelle statique à une régulation précise des processus dynamiques.

Lien d'origine:https://doi.org/10.1093/plcell/koae322

La spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) mesure quantitativement les propriétés moléculaires/nanoparticules, notamment la concentration molaire, la luminosité/l'état d'agrégation de la fluorescence, le coefficient de diffusion/rayon hydrodynamique et l'affinité d'interaction (KD), à une résolution de molécule unique dans des échantillons de solution à l'échelle du microlitre ou des cellules vivantes uniques. C'est un outil in situ, homogène, à haute teneur, compatible avec les échantillons physiologiques (lysats cellulaires, sang...).

Le FCS a été largement utilisé dans la signalisation cellulaire, la séparation de phase liquide-liquide, la dénaturation et l'agrégation biomoléculaires, les mécanismes structure-fonction, le développement de la nanomédecine, l'analyse des exosomes, l'ingénierie des sondes fluorescentes, le criblage d'anticorps et de médicaments et la microfluidique. Plus de 15 000 publications dans PubMed présentent le FCS et ses technologies dérivées.