El analizador de molécula única FCS ayuda al equipo de IGDB a revelar la dinámica de polimerización de xilano

El xilano es el segundo polisacárido más abundante en las paredes celulares de las plantas después de la celulosa, y desempeña un papel crítico en el mantenimiento de la integridad de la pared celular, la resistencia mecánica y la recalcitrancia de la biomasa.Su biosíntesis se basa en un complejo multienzimático conocido como complejo de xilanosíntasa (XSC)Sin embargo, los componentes centrales y los mecanismos bioquímicos de XSC siguen siendo en gran medida desconocidos.Instituto de Genética y Biología del Desarrollo, Academia de Ciencias de China (IGDB, CAS)publicó un estudio enLa célula vegetalcon derechoXYLAN O-ACETYLTRANSFERASE 6 promueve la síntesis de xilano formando un complejo con IRX10 y regula la formación de paredes en el arroz.

Este estudio identificóSe recomienda que se utilicen las siguientes sustancias:yIRX10 (una xilanosintasa)como componentes básicos de los XSC, formando el módulo básico funcional del complejo.Los resultados demostraron que XOAT6 no sólo acetiliza la columna vertebral del xilano, sino que también aumenta directamente la actividad de la polimerasa de IRX10.En conjunto, sintetizan acetileno acetileno de manera coordinada y eficiente.elongaciónymodificación, proporcionando una base teórica para la ingeniería de paredes celulares, el cultivo de cultivos de alto rendimiento y de alta calidad y el desarrollo de energía eficiente de biomasa.

El estudio planteó la hipótesis de que XOAT6 actúa no sólo como una acetiltransferasa, sino que también promueve directamente la polimerización de la columna vertebral (elongación) del xilano mediante la formación de un complejo con IRX10.Espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS)Se utilizó para monitorear los cambios cinéticos en tiempo real durante la polimerización, con el objetivo de explorar si y cómo XOAT6 influye en la actividad de la polimerasa IRX10 en condiciones casi fisiológicas de solución.

Como glucosiltransferasa, IRX10 funciona añadiendo nuevas unidades xilosílicas (donantes) al final de una cadena de xilano existente (aceptores).xilobiosa (X2)se ha utilizado como aceptor inicial, yUDP-xilozacomo sustrato donante.

X2 fue etiquetado con el colorante fluorescenteAlexa Fluor 488El radio hidrodinámico (RH) de las moléculas etiquetadas fluorescentemente se midió mediante función de autocorrelación para el seguimiento dinámico, reflejando el alargamiento de la cadena de xilano en tiempo real.

• Grupos de control: Etiquetado sólo como X2 + donante; o etiquetado como X2 + enzima (sin donante).
• Grupos experimentales: IRX10 + donante + etiquetado con X2 IRX10 + XOAT6 + donante + etiquetado con X2

• XOAT6 promueve fuertemente la polimerización: Cuando tanto IRX10 como XOAT6 estaban presentes, el cambio en RH fue mucho más significativo que con IRX10 solo, lo que indica que XOAT6 aumenta la actividad de la polimerasa de IRX10 (Figura 4C).
• Los cambios de RH surgen de la polimerización: Los experimentos de control no mostraron ningún cambio de RH cuando las reacciones contenían solo sustrato donante (UDP-Xyl) y X2 etiquetado con AF488, o solo enzima y etiquetado con X2 sin donante (Figura 4C).Esto confirma que los cambios de RH resultan específicamente de la polimerización de UDP-Xyl en X2 etiquetado con AF488..
• Monitoreo en tiempo real de la polimerización del xilano: Las mediciones continuas revelaron además que la tasa de aumento de RH se duplicó aproximadamente cuando IRX10 y XOAT6 actuaron juntos,Prueba directa de su promoción sinérgica del alargamiento de la cadena de xilano y una eficiencia de polimerización notablemente mejorada a nivel molecular (Figura 4D).

Figura 4Validación de las interacciones moleculares entre XOAT6, IRX10 y sus sustratos. (A) Ensayos MST: afinidad de unión (Kd) de XOAT6 y sus mutantes a IRX10 etiquetados. (B ∆ D) Ensayos FCS:Se utilizó xilobiosa etiquetada con AF488 para monitorear los cambios en la RH en tiempo real., que refleja el alargamiento de la cadena de xilano.

En este estudio, se utilizó la espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) para observar los cambios dinámicos durante la polimerización del xilano en tiempo real en elnivel de una sola molécula, mostrando claras fortalezas especialmente en la caracterización de cómo el complejo IRX10 XOAT6 promueve el alargamiento de la cadena de xilano:

• Monitoreo dinámico en tiempo real de una sola molécula: El FCS detecta el comportamiento de difusión de moléculas individuales etiquetadas con fluorescencia a concentraciones ultrabajas (pM·nM), lo que permite el seguimiento en tiempo real de los cambios del radio hidrodinámico durante la polimerización.En contraste, los métodos tradicionales como la espectrometría de masas y la electroforesis sólo analizan los productos del punto final y no pueden proporcionar datos dinámicos con resolución temporal.
• Detección nativa en solución: Los ensayos se realizan en solución homogénea en condiciones casi fisiológicas, sin inmovilización de la muestra ni alteración de las conformaciones proteicas nativas.La microscopía electrónica y la RMN requieren fijación o secado, lo que puede alterar el estado nativo de los complejos de proteínas.

Este estudio revela, por primera vez, el papel central del complejo IRX10XOAT6 en la biosíntesis del xilano de arroz.y propiedades de la biomasa mediante catalización coordinada y regulación estructural a través del mecanismo molecularEstos hallazgos proporcionan una importante base teórica y soporte técnico para la mejora genética de los cultivos, la utilización eficiente de la biomasa, la mejora de la calidad de los cultivos y la mejora de la calidad de la producción.y biología de las paredes celulares de las plantas.

El FCS se aplicó por primera vez a la biosíntesis de polisacáridos de la pared celular vegetal, superando las limitaciones de los métodos convencionales.visualización y cuantificación dinámica de una sola molécula en tiempo realEl estudio de las interacciones biomoleculares y las reacciones enzimáticas en solución en condiciones casi fisiológicas, establece un nuevo paradigma para el estudio de los mecanismos de síntesis de tales macromoléculas.Como técnica potente para el monitoreo en tiempo real de la dinámica biomolecular a nivel de una sola molécula en solución, la FCS es muy prometedora, especialmente para procesos biológicos dinámicos, desarrollo de fármacos y nanotecnología,y se espera que conduzca la investigación en ciencias de la vida desde el análisis estructural estático hacia la regulación precisa de los procesos dinámicos.

Enlace original:El objetivo de la presente Decisión es garantizar que los Estados miembros cumplan los requisitos establecidos en el presente Reglamento.

Espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) mide cuantitativamente las propiedades moleculares/nanopartículas, incluida la concentración molar, el brillo de fluorescencia/estado de agregación,coeficiente de difusión/radio hidrodinámico, y afinidad de interacción (KD) ∆ a resolución de una sola molécula en muestras de solución a escala de microlitros o en células vivas individuales.herramienta de alto contenido compatible con muestras fisiológicas (lisatos celulares), sangre, etc.).

El FCS se ha utilizado ampliamente en señalización celular, separación de fase líquida-líquida, desnaturalización y agregación biomolecular, mecanismos de estructura-función, desarrollo de nanomedicina, análisis de exosomas,ingeniería de sondas fluorescentesMás de 15.000 publicaciones en PubMed presentan el FCS y sus tecnologías derivadas.