El analizador de molécula única FCS ayuda al equipo de IGDB a revelar la dinámica de polimerización de xilano

El xilano es el segundo polisacárido más abundante en las paredes celulares de las plantas después de la celulosa y desempeña un papel fundamental en el mantenimiento de la integridad de la pared celular, la resistencia mecánica y la recalcitrancia de la biomasa. Su biosíntesis se basa en un complejo multienzimático conocido como complejo xilano sintasa (XSC). Sin embargo, los componentes centrales y los mecanismos bioquímicos del XSC siguen siendo en gran medida desconocidos. Recientemente, un equipo de investigación dirigido por Baocai Zhang delInstituto de Genética y Biología del Desarrollo, Academia China de Ciencias (IGDB, CAS)publicó un estudio enLa célula vegetalcon derechoXYLAN O-ACETILTRANSFERASA 6 promueve la síntesis de xilano formando un complejo con IRX10 y gobierna la formación de paredes en el arroz.

Este estudio identificóXYLAN O-ACETILTRANSFERASA 6 (XOAT6)yIRX10 (una xilano sintasa)como componentes centrales de XSC, formando el módulo central funcional del complejo. Los resultados demostraron que XOAT6 no solo acetila la columna vertebral de xilano sino que también mejora directamente la actividad polimerasa de IRX10. Juntos, sintetizan de manera coordinada y eficiente xilano acetilado. Por primera vez a nivel molecular, este trabajo revela los mecanismos subyacentes a la cadena de xilanoalargamientoymodificación, proporcionando una base teórica para la ingeniería de paredes celulares, el cultivo de cultivos de alto rendimiento y alta calidad y el desarrollo de energía de biomasa eficiente.

El estudio planteó la hipótesis de que XOAT6 actúa no solo como una acetiltransferasa sino que también promueve directamente la polimerización (alargamiento) de la columna vertebral del xilano formando un complejo con IRX10. Para probar esto,Espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS)se utilizó para monitorear los cambios cinéticos en tiempo real durante la polimerización, con el objetivo de explorar si XOAT6 influye en la actividad de la polimerasa IRX10 y cómo en condiciones de solución casi fisiológicas.

Como glicosiltransferasa, IRX10 funciona agregando nuevas unidades de xilosil (donante) al final de una cadena de xilano existente (aceptor). En este estudio,xilobiosa (X2)se utilizó como aceptor inicial, yUDP-xilosacomo sustrato donante.

X2 fue marcado con el tinte fluorescente.Alexa Flúor 488(Figura 4B). El radio hidrodinámico (RH) de las moléculas marcadas con fluorescencia se midió mediante una función de autocorrelación para el seguimiento dinámico, que refleja el alargamiento de la cadena de xilano en tiempo real.

• Grupos de control: Solo donante etiquetado X2 +; o enzima X2+ marcada (sin donante).
• Grupos experimentales: IRX10 + donante + X2 etiquetado IRX10 + XOAT6 + donante + X2 etiquetado

• XOAT6 promueve fuertemente la polimerización: Cuando estaban presentes IRX10 y XOAT6, el cambio en la RH fue mucho más significativo que con IRX10 solo, lo que indica que XOAT6 mejora la actividad polimerasa de IRX10 (Figura 4C).
• Los cambios de humedad relativa surgen de la polimerización.: Los experimentos de control no mostraron ningún cambio de RH cuando las reacciones contenían solo sustrato donante (UDP-Xyl) y X2 marcado con AF488, o solo enzima y X2 marcado sin donante (Figura 4C). Esto confirma que los cambios de RH resultan específicamente de la polimerización de UDP-Xyl en X2 marcado con AF488.
• Monitoreo en tiempo real de la polimerización de xilano.: Las mediciones continuas revelaron además que la tasa de aumento de RH aproximadamente se duplicó cuando IRX10 y XOAT6 actuaron juntos, lo que demuestra directamente su promoción sinérgica del alargamiento de la cadena de xilano y una eficiencia de polimerización notablemente mejorada a nivel molecular (Figura 4D).

Figura 4Validación de interacciones moleculares entre XOAT6, IRX10 y sus sustratos. (A) Ensayo MST: afinidad de unión (Kd) de XOAT6 y sus mutantes a IRX10 marcado. (B – D) Ensayos de FCS: se utilizó xilobiosa marcada con AF488 para monitorear los cambios en la RH en tiempo real, lo que refleja el alargamiento de la cadena de xilano.

En este estudio, se utilizó espectroscopía de correlación de fluorescencia (FCS) para observar cambios dinámicos durante la polimerización de xilano en tiempo real en elnivel de una sola molécula, mostrando fortalezas claras, especialmente al caracterizar cómo el complejo IRX10-XOAT6 promueve el alargamiento de la cadena de xilano:

• Monitoreo dinámico en tiempo real de una sola molécula: FCS detecta el comportamiento de difusión de moléculas individuales marcadas con fluorescencia en concentraciones ultrabajas (pM-nM), lo que permite el seguimiento en tiempo real de los cambios del radio hidrodinámico durante la polimerización. Por el contrario, los métodos tradicionales como la espectrometría de masas y la electroforesis solo analizan productos de punto final y no pueden proporcionar datos dinámicos resueltos en el tiempo.
• Detección nativa en solución: Los ensayos se realizan en una solución homogénea en condiciones casi fisiológicas, sin inmovilización de la muestra ni alteración de las conformaciones de las proteínas nativas. La microscopía electrónica y la RMN requieren fijación o secado, lo que puede alterar el estado nativo de los complejos proteicos.

Este estudio revela, por primera vez, el papel central del complejo IRX10-XOAT6 en la biosíntesis de xilano de arroz. Aclara sistemáticamente cómo este complejo afecta el crecimiento, el desarrollo y las propiedades de la biomasa de las plantas a través de catálisis coordinada y regulación estructural a través del mecanismo molecular, la arquitectura de la pared celular y la biomecánica. Estos hallazgos proporcionan una importante base teórica y apoyo técnico para el mejoramiento genético de cultivos, la utilización eficiente de la biomasa y la biología de la pared celular de las plantas.

FCS se aplicó por primera vez a la biosíntesis de polisacáridos de la pared celular de plantas, superando las limitaciones de los métodos convencionales. Permitevisualización y cuantificación dinámica de una sola molécula en tiempo realde interacciones biomoleculares y reacciones enzimáticas en solución en condiciones casi fisiológicas, estableciendo un nuevo paradigma para estudiar los mecanismos de síntesis de tales macromoléculas. Como técnica poderosa para el monitoreo en tiempo real de la dinámica biomolecular a nivel de una sola molécula en solución, FCS es muy prometedora, especialmente para procesos biológicos dinámicos, desarrollo de fármacos y nanotecnología, y se espera que impulse la investigación en ciencias biológicas desde el análisis estructural estático hacia una regulación precisa de los procesos dinámicos.

Enlace original:https://doi.org/10.1093/plcell/koae322

La espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) mide cuantitativamente las propiedades moleculares/de nanopartículas, incluida la concentración molar, el brillo/estado de agregación de la fluorescencia, el coeficiente de difusión/radio hidrodinámico y la afinidad de interacción (KD), con resolución de una sola molécula en muestras de solución a escala de microlitros o células vivas individuales. Es una herramienta in situ, homogénea y de alto contenido compatible con muestras fisiológicas (lisados ​​celulares, sangre, etc.).

FCS se ha utilizado ampliamente en señalización celular, separación de fases líquido-líquido, desnaturalización y agregación biomolecular, mecanismos estructura-función, desarrollo de nanomedicina, análisis de exosomas, ingeniería de sondas fluorescentes, detección de anticuerpos y fármacos, y microfluidos. Más de 15.000 publicaciones en PubMed presentan FCS y sus tecnologías derivadas.