FCS単分子解析器がIGDBチームにXylanポリメリゼーション動態を明らかにする

クジランはセルロースに次いで植物細胞壁に最も多く含まれている二次多量のポリサカリドであり,細胞壁の整合性,機械的強度,生物質の頑丈性を維持する上で重要な役割を果たします.バイオシンセスは,キシラン合成酶複合体 (XSC) と呼ばれる多酵素複合体に依存していますしかし,XSC の核成分と生化学的メカニズムはほとんど不明である.最近,中国科学アカデミー (IGDB,CAS) の遺伝学と発達生物学研究所研究を発表した.植物 の 細胞権利XYLAN O-ACETYLTRANSFERASE 6は,IRX10と複合体を形成することによってキシラン合成を促進し,米の壁形成を制御する..

この研究では,クジランOアセチルトランスフェレーゼ6 (XOAT6)そしてIRX10 (キシラン合成酶)XSCのコアコンポーネントとして,複合体の機能コアモジュールを形成する.XOAT6は,キシランの骨組みをアセチル化するだけでなく,IRX10のポリマレス活性も直接強化することを示した.この研究により,分子レベルで初めて,キシラン鎖の背後にあるメカニズムが明らかになりました.伸縮そして変更細胞壁工学,高産量高品質の作物の育成,そして効率的なバイオマスエネルギーの開発のための理論的基盤を提供します.

研究では,XOAT6はアセチルトランスフェラーゼとして作用するだけでなく,IRX10と複合体を形成することで,キシランの脊髄ポリメライゼーション (長縮) を直接促進すると仮定した.発光相関スペクトロピー (FCS)XOAT6が近生理的溶液条件下でのIRX10ポリマレス活性にどのように影響するのかを調査するために,ポリマライゼーション中のリアルタイム運動変化をモニターするために使用されました.

IRX10は,グリコシルトランスフェラーゼとして,既存のキシラン鎖 (受容体) の末端に新しいキシロシル単位 (ドナー) を追加して機能します.キシロボース (X2)初期受容体として使用され,UDP-キシロースドナー基質として

X2は,熒光染料でラベルされていましたアレクサ・フローア 488(図4B) 発光ラベルを付けられた分子の水力力学半径 (RH) は,動的追跡のための自動相関関数を使用して測定され,キシラン鎖の長さをリアルタイムで反映した.

• コントロールグループ: X2+ドナーのみにラベル付け;またはX2+酵素 (ドナーなし) にラベル付け.
• 実験グループ: IRX10 + ドナー + ラベル付きX2 IRX10 + XOAT6 + ドナー + ラベル付きX2

• XOAT6 は ポリメリゼーション を 強烈 に 促進 する: IRX10 と XOAT6 が両方存在する場合,RH の変化は IRX10 単独よりもはるかに有意であり,XOAT6 が IRX10 のポリマレーズ活性を増強することを示しています (図 4C).
• RHの変化はポリメリゼーションから生じる: 対照実験では,ドナー基板 (UDP-Xyl) と AF488 レーベル付き X2 のみ,またはドナーなしの酵素とレーベル付き X2 のみを含む反応では,RH 変化が示されなかった (図 4C).これは,RHの変化が,UDP-XylをAF488と標識されたX2にポリメライズした結果であることを確認します..
• キシランポリメリゼーションのリアルタイムモニタリングIRX10とXOAT6が一緒に作用したとき,RH増加率は約2倍になったことが,連続測定により明らかになりました.クジラン連鎖の長さを促進し,分子レベルでポリメリゼーション効率を著しく向上させることを直接証明する (図4D).

図 4XOAT6,IRX10,およびそれらの基質の間の分子相互作用の検証. (A) MSTアッセイ:XOAT6とその変異体のIRX10とラベル付き結合親和性 (Kd): (B D) FCSアッセイ:AF488と表示されたキシロボーズは,RHの変化をリアルタイムで監視するために使用されました.ゼイラン鎖の長さを反映している.

この研究では,フルオレセンスの相関スペクトロスコピー (FCS) を用いて,キシランポリメリゼーション中の動的変化をリアルタイムで観測しました.単分子レベルIRX10XOAT6複合体がキシラン連鎖の長さを促進する方法を特徴づけることにおいて,特に明確な強みを示しています.

• 単分子のリアルタイムダイナミックモニタリング: FCSは,極低濃度 (pM ∞ NM) で,フラウレッセンスのラベル付きの個々の分子の拡散行動を検知し,ポリメリゼーション中に水力学半径の変化をリアルタイムに追跡することができます.反対に質量スペクトロメトリや電球解離などの従来の方法は,最終点製品のみを分析し,時間解析のダイナミックデータを提供することはできません.
• 溶液内,ネイティブ検出: 検定は,サンプルを固定したり,ネイティブタンパク質構成を乱したりすることなく,ほぼ生理学的条件下で均質な溶液で行われます.電子顕微鏡とNMRでは固定または乾燥が必要ですタンパク質複合体の本来の状態を変化させる可能性があります.

この研究では,米キシラン生物合成における IRX10XOAT6複合体の中心的な役割を初めて明らかにし,この複合体が植物の成長,発達,分子メカニズム全体で協調した催化と構造的調節によってこれらの発見は,作物の遺伝子改良,効率的なバイオマスの利用,植物細胞壁生物学.

植物細胞壁ポリサカリド生物合成に初めて適用され,従来の方法の限界を克服しました.リアルタイムで単分子動的視覚化と定量化生物分子相互作用と溶液中の酵素反応をほぼ生理学的条件下で研究し,そのようなマクロ分子の合成メカニズムの研究のための新しいパラダイムを確立しました溶液中の単一分子レベルでの生物分子ダイナミクスのリアルタイムモニタリングのための強力な技術として特にダイナミックな生物学的プロセス,薬剤開発,ナノテクノロジーにおいて静的構造分析から ダイナミックプロセスの正確な規制へと 生命科学の研究を推進すると期待されています.

オリジナルリンク:https://doi.org/10.1093/plcell/koae322

フロレセンスの相関スペクトロピー (FCS) は,分子/ナノ粒子の特性を量的に測定する.モラー濃度,フロレセンスの明るさ/アグリゲーション状態を含む.拡散係数/水力学半径単一分子解像度におけるマイクロリットルスケール溶液サンプルまたは単一の生体細胞における相互作用親和性 (KD)高濃度ツールで生理学的サンプル (細胞リサート) と互換性がある血液など)

FCSは,細胞信号伝達,液体・液体相分離,生物分子変性および集積,構造・機能メカニズム,ナノ医学開発,外生体分析,流光探査機工学PubMed の 15,000 冊以上の出版物では,FCS とその派生技術について記述されています.