FCS-Einmolekül-Analysator hilft dem IGDB-Team, die Dynamik der Xylan-Polymerisation aufzudecken

Xylan ist das zweithäufigste Polysaccharid in Pflanzenzellwänden nach Zellulose und spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Zellwandintegrität, der mechanischen Festigkeit und der Biomasse.Seine Biosynthese beruht auf einem Multi-Enzym-Komplex namens Xylan-Synthase-Komplex (XSC)Die Kernbestandteile und biochemischen Mechanismen von XSC sind jedoch weitgehend unbekannt.Institut für Genetik und Entwicklungsbiologie, Chinesische Akademie der Wissenschaften (IGDB, CAS)In derDie PflanzenzelleAnspruch aufXYLAN O-ACETYLTRANSFERASE 6 fördert die Xylan-Synthese durch Bildung eines Komplexes mit IRX10 und regelt die Wandbildung in Reis.

Diese Studie identifizierteXylan O-Acetyltransferase 6 (XOAT6)undIRX10 (eine Xylan-Synthase)als Kernkomponenten von XSCs, die das funktionale Kernmodul des Komplexes bilden.Die Ergebnisse zeigten, dass XOAT6 nicht nur das Xylan-Rückgrat acetyliert, sondern auch die Polymerase-Aktivität von IRX10 direkt erhöht.Zusammen synthetisieren sie acetyliertes Xylan koordiniert und effizient.VerlängerungundÄnderung, die eine theoretische Grundlage für die Zellwandtechnik, die Züchtung von hochproduktiven und hochwertigen Pflanzen und die Entwicklung effizienter Biomasseenergie bietet.

Die Studie vermutete, dass XOAT6 nicht nur als Acetyltransferase wirkt, sondern auch die Rückgratpolymerisation (Verlängerung) von Xylan direkt fördert, indem er einen Komplex mit IRX10 bildet.Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS)wurde verwendet, um in Echtzeit kinetische Veränderungen während der Polymerisation zu überwachen, um zu untersuchen, ob und wie XOAT6 die IRX10-Polymerase-Aktivität unter fast physiologischen Lösungsbedingungen beeinflusst.

Als Glykosyltransferase funktioniert IRX10 durch Hinzufügen neuer Xylosyl-Einheiten (Spender) an das Ende einer vorhandenen Xylankette (Akzeptor).Xylobiose (X2)als Erstakzeptor verwendet wurde undUDP-Xyloseals Spendersubstrat.

X2 wurde mit dem fluoreszierenden Farbstoff gekennzeichnetAlexa Fluor 488(Abbildung 4B). Der hydrodynamische Radius (RH) von fluoreszierend markierten Molekülen wurde mittels Autocorrelationsfunktion zur dynamischen Verfolgung gemessen, die die Xylankettenverlängerung in Echtzeit widerspiegelt.

• Kontrollgruppen: nur als X2 + Spender gekennzeichnet; oder als X2 + Enzym (ohne Spender).
• Versuchsgruppen: IRX10 + Spender + gekennzeichnet X2 IRX10 + XOAT6 + Spender + gekennzeichnet X2

• XOAT6 fördert die Polymerisation stark: Wenn sowohl IRX10 als auch XOAT6 vorhanden waren, war die Veränderung der RH weitaus signifikanter als bei IRX10 allein, was darauf hindeutet, dass XOAT6 die Polymeraseaktivität von IRX10 erhöht (Abbildung 4C).
• RH-Veränderungen entstehen durch Polymerisation: Kontrollversuche zeigten keine RH-Verlagerung, wenn die Reaktionen nur Spendersubstrat (UDP-Xyl) und AF488-markiertes X2 oder nur Enzym und ohne Spender markiertes X2 enthielten (Abbildung 4C).Dies bestätigt, dass RH-Veränderungen speziell durch die Polymerisation von UDP-Xyl auf AF488-markiertes X2 entstehen..
• Echtzeitüberwachung der Xylanpolymerisation: Kontinuierliche Messungen ergaben ferner, dass sich die RH-Erhöhungsrate, wenn IRX10 und XOAT6 zusammenwirkten, etwa verdoppelte,direkt nachweislich synergistisch die Xylankettenverlängerung fördern und die Polymerisationseffizienz auf molekularer Ebene deutlich verbessern (Abbildung 4D).

Abbildung 4Validierung der molekularen Wechselwirkungen zwischen XOAT6, IRX10 und ihren Substraten. (A) MST-Assay: Bindungsaffinität (Kd) von XOAT6 und seinen Mutanten an die mit IRX10 gekennzeichneten Substanzen. (B?? D) FCS-Assays:Xylobiose mit AF488-Kennzeichnung wurde verwendet, um Veränderungen der RH in Echtzeit zu überwachen., die die Xylankettenverlängerung widerspiegelt.

In dieser Studie wurde die Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS) verwendet, um dynamische Veränderungen während der Xylan-Polymerisation in Echtzeit an derEinmolekülniveau, die deutliche Stärken aufweisen, insbesondere bei der Charakterisierung, wie der IRX10XOAT6-Komplex die Xylankettenverlängerung fördert:

• Echtzeit-Dynamiküberwachung für einzelne Moleküle: FCS erkennt das Diffusionsverhalten einzelner fluoreszierend gekennzeichneter Moleküle bei ultra-niedrigen Konzentrationen (pM ¢ nM), wodurch die hydrodynamischen Radiusänderungen während der Polymerisation in Echtzeit nachverfolgt werden können.Im Gegensatz dazu, herkömmliche Methoden wie Massenspektrometrie und Elektrophorese analysieren nur Endpunktprodukte und können keine zeitlich aufgelösten dynamischen Daten liefern.
• In-Lösung, native Detektion: Die Prüfungen werden in homogener Lösung unter fast physiologischen Bedingungen durchgeführt, ohne dass die Probe immobilisiert oder die natürlichen Proteinkonformationen gestört werden.Elektronenmikroskopie und NMR erfordern Fixierung oder Trocknung, die den natürlichen Zustand von Proteinkomplexen verändern können.

Diese Studie zeigt erstmals die zentrale Rolle des IRX10XOAT6-Komplexes in der Biosynthese von Reisxylan und verdeutlicht systematisch, wie dieser Komplex das Wachstum, die Entwicklung und die Wirkung auf die Pflanzen beeinflusst.und Biomasse durch koordinierte Katalyse und Strukturregulierung über den molekularen MechanismusDiese Ergebnisse liefern eine wichtige theoretische Grundlage und technische Unterstützung für die genetische Verbesserung der Pflanzen, die effiziente Nutzung der Biomasse, die Verbesserung derund Pflanzenzellwandbiologie.

FCS wurde erstmals auf die Biosynthese von Polysacchariden aus Pflanzenzellwänden angewendet, wodurch die Einschränkungen herkömmlicher Methoden überwunden wurden.Echtzeit-Dynamikvisualisierung und -Quantifizierung für einzelne MoleküleDie Ergebnisse der Studie zeigen, daß die biologische und enzymatische Wechselwirkung in einer Lösung unter fast physiologischen Bedingungen ein neues Paradigma für die Untersuchung der Synthese von Makromolekülen darstellt.Als leistungsfähige Technik zur Echtzeitüberwachung der biomolekularen Dynamik auf einzelmolekularer Ebene in Lösung, FCS ist vielversprechend, insbesondere für dynamische biologische Prozesse, die Entwicklung von Arzneimitteln und Nanotechnologie,und wird erwartet, dass die Forschung in den Biowissenschaften von der statischen Strukturanalyse zur präzisen Regulierung dynamischer Prozesse.

Originalverbindung:Die Kommission hat die Kommission aufgefordert, die folgenden Informationen zu übermitteln:

Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS) misst quantitativ molekulare/nanopartikuläre Eigenschaften, einschließlich Molarkonzentration, Fluoreszenzhelligkeit/Aggregationszustand,Diffusionskoeffizient/hydrodynamischer Radius, und Wechselwirkungsaffinität (KD) ∆ bei Einzelmolekül-Auflösung in Mikroliterlösungsproben oder einzelnen lebenden Zellen.mit einem hohen Gehalt an Werkzeug, das mit physiologischen Proben (Zelllysate) kompatibel ist, Blut usw.).

FCS wurde in der Zellsignalisierung, in der Trennung der flüssigen/flüssigen Phasen, in der biomolekularen Denaturierung und Aggregation, in Struktur-/Funktionsmechanismen, in der Entwicklung von Nanomedizin, in der Exosomanalyse,FluoreszenzsondetechnikMehr als 15.000 Publikationen in PubMed behandeln FCS und seine abgeleiteten Technologien.