Анализатор одиночных молекул FCS помогает команде IGDB выявить динамику полимеризации ксилана

Ксилан является вторым наиболее распространенным полисахаридом в клеточных стенках растений после целлюлозы и играет важную роль в поддержании целостности клеточных стен, механической прочности и резалцитации биомассы.Его биосинтез основан на мультиэнзимном комплексе, известном как комплекс ксилансинтазы (XSC)Однако основные компоненты и биохимические механизмы XSC остаются в значительной степени неизвестными.Институт генетики и биологии развития, Китайская академия наук (IGDB, CAS)опубликовал исследование вРастительная клеткаимеют правоXYLAN O-ACETYLTRANSFERASE 6 способствует синтезу ксилана путем образования комплекса с IRX10 и регулирует образование стенки в рисе.

Это исследование определилоКсилан О-ацетилтрансфераза 6 (XOAT6)иIRX10 (ксилансинтаза)как основные компоненты XSC, образующие функциональный основной модуль комплекса.Результаты показали, что XOAT6 не только ацетилирует ксиланный позвоночник, но и напрямую повышает активность полимеразы IRX10.Вместе они координируют и эффективно синтезируют ацетилированный ксилан. Впервые на молекулярном уровне эта работа раскрывает механизмы, лежащие в основе ксиланной цепи.удлинениеиизменение, обеспечивая теоретическую основу для разработки клеточных стен, выращивания высокоурожайных и качественных культур и развития эффективной энергии из биомассы.

Исследование выдвинуло гипотезу, что XOAT6 действует не только как ацетилтрансфераза, но также напрямую способствует полимеризации (удлинению) спинного мозга ксилана путем образования комплекса с IRX10.Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (ФКС)был использован для мониторинга кинетических изменений в режиме реального времени во время полимеризации, целью которого было изучение того, влияет ли XOAT6 на активность полимеразы IRX10 в условиях почти физиологического раствора.

Как гликозилтрансфераза, IRX10 функционирует путем добавления новых ксилозильных единиц (доноров) к концу существующей ксиланной цепи (акцепторов).ксилобиоза (X2)использовался в качестве первоначального приемника, иUDP-ксилозакак донорский субстрат.

X2 был помечен флуоресцентным красителемАлекса Флюор 488Гидродинамический радиус (RH) флуоресцентно маркированных молекул измерялся с помощью функции автокорреляции для динамического отслеживания, отражающей удлинение ксиланной цепи в реальном времени.

• Контрольные группы: маркируется только донором X2 +; или маркируется ферментом X2 + (без донора).
• Испытательные группы: IRX10 + донор + маркированный X2 IRX10 + XOAT6 + донор + маркированный X2

• XOAT6 сильно способствует полимеризации: При наличии IRX10 и XOAT6 изменение RH было гораздо более значительным, чем при одном только IRX10, что указывает на то, что XOAT6 повышает активность полимеразы IRX10 (рисунок 4C).
• Изменения RH возникают в результате полимеризации: контрольные эксперименты не показали никакого сдвига RH, когда реакции содержали только субстрат донора (UDP-Xyl) и маркированный AF488 X2, или только фермент и маркированный X2 без донора (рисунок 4C).Это подтверждает, что изменения РХ происходят именно в результате полимеризации UDP-Xyl на AF488- маркированный X2.
• Мониторинг полимеризации ксилана в режиме реального времениПродолжительные измерения также показали, что скорость повышения RH примерно удвоилась, когда IRX10 и XOAT6 действовали вместе.непосредственно доказывая их синергетическое продвижение ксилан-цепочки удлинения и заметно повышенную эффективность полимеризации на молекулярном уровне (рисунок 4D).

Рисунок 4Валидация молекулярных взаимодействий между XOAT6, IRX10 и их субстратами. (A) Анализ MST: аффинность связывания (Kd) XOAT6 и его мутантов с маркированными IRX10. (B ∆ D) Анализ FCS:Ксилобиоз с маркировкой AF488 использовался для мониторинга изменений РГ в реальном времени., отражающий удлинение ксиланной цепи.

В данном исследовании для наблюдения динамических изменений во время полимеризации ксилана в режиме реального времени на поверхности использовалась флуоресцентная корреляционная спектроскопия (ФКС).уровень одной молекулы, демонстрируя явные сильные стороны, особенно в характеристике того, как комплекс IRX10XOAT6 способствует удлинению ксиланной цепи:

• Динамическое наблюдение в режиме реального времени по одной молекуле: FCS обнаруживает диффузионное поведение отдельных флуоресцентно маркированных молекул при сверхнизких концентрациях (pM·nM), что позволяет отслеживать изменения гидродинамического радиуса в режиме реального времени во время полимеризации.В отличие, традиционные методы, такие как массовая спектрометрия и электрофорез, анализируют только конечные продукты и не могут предоставить динамические данные с временным разрешением.
• В растворе, локальное обнаружение: Испытания проводятся в однородном растворе в почти физиологических условиях, без иммобилизации образца или нарушения конформации естественных белков.Электронная микроскопия и МРТ требуют фиксации или сушки, что может изменить естественное состояние белковых комплексов.

Это исследование впервые раскрывает центральную роль комплекса IRX10XOAT6 в биосинтезе рисового ксилана.и свойства биомассы посредством скоординированного катализа и структурного регулирования через молекулярный механизмЭти результаты обеспечивают важную теоретическую основу и техническую поддержку для улучшения генетики сельскохозяйственных культур, эффективного использования биомассы,и биология стенки клеток растений.

Впервые FCS был применен к биосинтезу полисахаридов клеточной стенки растений, преодолев ограничения традиционных методов.Динамическая визуализация и количественное определение одной молекулы в режиме реального времениВ результате исследований биомолекулярных взаимодействий и ферментативных реакций в растворе в условиях, близких к физиологическим, была создана новая парадигма для изучения механизмов синтеза таких макромолекул.Как мощный метод мониторинга биомолекулярной динамики в режиме реального времени на уровне одной молекулы в растворе, FCS имеет большие перспективы, особенно для динамических биологических процессов, разработки лекарств и нанотехнологий,и ожидается, что он будет направлять биологические исследования от статического структурного анализа к точному регулированию динамических процессов.

Оригинальная ссылка:https://doi.org/10.1093/plcell/koae322

Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS) количественно измеряет свойства молекулярных/наночастиц, включая молярную концентрацию, яркость флуоресценции/состояние агрегации,коэффициент диффузии/гидродинамический радиус, и аффинность взаимодействия (KD) ≈ при одномолекулярном разрешении в образцах микролитрового раствора или отдельных живых клетках.инструмент с высоким содержанием, совместимый с физиологическими образцами (лизаты клеток), кровь и т.д.).

ФКС широко используется в клеточной сигнализации, разделе жидкой/жидкой фазы, биомолекулярной денатурации и агрегации, структуре/функциональных механизмах, разработке наномедицины, анализе экзосом,Флуоресцентная инженерная работаБолее 15 000 публикаций в PubMed рассказывают о FCS и его производных технологиях.