Анализатор одиночных молекул FCS помогает команде IGDB выявить динамику полимеризации ксилана

Ксилан является вторым по распространенности полисахаридом в стенках растительных клеток после целлюлозы и играет решающую роль в поддержании целостности клеточной стенки, механической прочности и устойчивости биомассы. Его биосинтез основан на мультиферментном комплексе, известном как комплекс ксилансинтазы (XSC). Однако основные компоненты и биохимические механизмы XSC остаются в значительной степени неизвестными. Недавно исследовательская группа под руководством Баокая Чжана изИнститут генетики и биологии развития Китайской академии наук (IGDB, CAS)опубликовал исследование вРастительная клеткауполномоченныйКСИЛАН-О-АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗА 6 способствует синтезу ксилана путем образования комплекса с IRX10 и регулирует образование стенок в рисе..

Это исследование выявилоКСИЛАН-О-АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗА 6 (XOAT6)иIRX10 (ксилансинтаза)в качестве основных компонентов ХСК, образующих функциональный базовый модуль комплекса. Результаты показали, что XOAT6 не только ацетилирует ксилановый остов, но и напрямую усиливает полимеразную активность IRX10. Вместе они координировано и эффективно синтезируют ацетилированный ксилан. Впервые на молекулярном уровне эта работа раскрывает механизмы, лежащие в основе цепи ксилана.удлинениеимодификация, обеспечивая теоретическую основу для инженерии клеточных стенок, выращивания высокоурожайных и высококачественных сельскохозяйственных культур и разработки эффективной энергии биомассы.

Исследование предположило, что XOAT6 действует не только как ацетилтрансфераза, но также напрямую способствует полимеризации (удлинению) основной цепи ксилана путем образования комплекса с IRX10. Чтобы проверить это,Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS)был использован для мониторинга кинетических изменений в реальном времени во время полимеризации с целью выяснить, влияет ли XOAT6 на активность полимеразы IRX10 и каким образом в условиях, близких к физиологическому раствору.

Как гликозилтрансфераза, IRX10 действует путем добавления новых ксилозильных единиц (донор) к концу существующей ксилановой цепи (акцептор). В этом исследованииксилобиоза (X2)использовался в качестве первоначального акцептора, аUDP-ксилозав качестве донорского субстрата.

X2 был помечен флуоресцентным красителем.Алекса Флюор 488(Рисунок 4Б). Гидродинамический радиус (RH) флуоресцентно меченных молекул измеряли с помощью автокорреляционной функции для динамического отслеживания, отражающей удлинение цепи ксилана в реальном времени.

• Контрольные группы: Маркировка X2 + только донор; или меченый фермент Х2+ (без донора).
• Экспериментальные группы: IRX10 + донор + маркировка X2 IRX10 + XOAT6 + донор + маркировка X2

• XOAT6 сильно способствует полимеризации.: Когда присутствовали и IRX10, и XOAT6, изменение относительной влажности было гораздо более значительным, чем при использовании одного IRX10, что указывает на то, что XOAT6 усиливает полимеразную активность IRX10 (рис. 4C).
• Изменения относительной влажности возникают в результате полимеризации.: Контрольные эксперименты не показали сдвига RH, когда реакции содержали только донорный субстрат (UDP-Xyl) и меченный AF488 X2 или только фермент и меченный X2 без донора (рис. 4C). Это подтверждает, что изменения относительной влажности происходят именно в результате полимеризации UDP-ксила на X2, меченном AF488.
• Мониторинг полимеризации ксилана в реальном времени: Непрерывные измерения также показали, что скорость увеличения относительной влажности примерно удваивалась, когда IRX10 и XOAT6 действовали вместе, что напрямую доказывает их синергетическое стимулирование удлинения цепи ксилана и заметное улучшение эффективности полимеризации на молекулярном уровне (рис. 4D).

Рисунок 4Проверка молекулярных взаимодействий между XOAT6, IRX10 и их субстратами. (A) Анализ MST: аффинность связывания (Kd) XOAT6 и его мутантов с меченым IRX10. (B – D) Анализы FCS: ксилобиозу, меченную AF488, использовали для мониторинга изменений относительной влажности в реальном времени, отражающих удлинение цепи ксилана.

В этом исследовании флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS) использовалась для наблюдения динамических изменений во время полимеризации ксилана в реальном времени приодномолекулярный уровень, демонстрируя явные сильные стороны, особенно при характеристике того, как комплекс IRX10-XOAT6 способствует удлинению цепи ксилана:

• Динамический мониторинг одной молекулы в реальном времени: FCS обнаруживает диффузионное поведение отдельных флуоресцентно-меченых молекул при сверхнизких концентрациях (пМ–нМ), что позволяет в режиме реального времени отслеживать изменения гидродинамического радиуса во время полимеризации. Напротив, традиционные методы, такие как масс-спектрометрия и электрофорез, анализируют только конечные продукты и не могут предоставить динамические данные с временным разрешением.
• В растворе, нативное обнаружение: Анализы проводятся в гомогенном растворе в условиях, близких к физиологическим, без иммобилизации образца или нарушения конформаций нативного белка. Электронная микроскопия и ЯМР требуют фиксации или сушки, что может изменить нативное состояние белковых комплексов.

Это исследование впервые раскрывает центральную роль комплекса IRX10-XOAT6 в биосинтезе ксилана риса. Он систематически объясняет, как этот комплекс влияет на рост, развитие и свойства биомассы растений посредством скоординированного катализа и структурной регуляции молекулярного механизма, архитектуры клеточной стенки и биомеханики. Эти результаты обеспечивают важную теоретическую основу и техническую поддержку для генетического улучшения сельскохозяйственных культур, эффективного использования биомассы и биологии клеточных стенок растений.

FCS впервые был применен для биосинтеза полисахаридов клеточной стенки растений, преодолев ограничения традиционных методов. Это позволяетДинамическая визуализация и количественный анализ одиночных молекул в реальном временибиомолекулярных взаимодействий и ферментативных реакций в растворах в условиях, близких к физиологическим, устанавливающих новую парадигму изучения механизмов синтеза таких макромолекул. Будучи мощным методом мониторинга биомолекулярной динамики в режиме реального времени на уровне отдельных молекул в растворе, FCS имеет большие перспективы, особенно для динамических биологических процессов, разработки лекарств и нанотехнологий, и, как ожидается, будет способствовать развитию медико-биологических исследований от статического структурного анализа к точному регулированию динамических процессов.

Исходная ссылка:https://doi.org/10.1093/plcell/koae322

Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS) количественно измеряет свойства молекул/наночастиц, включая молярную концентрацию, яркость флуоресценции/агрегационное состояние, коэффициент диффузии/гидродинамический радиус и сродство взаимодействия (KD) – с разрешением одной молекулы в образцах раствора в микролитрах или отдельных живых клетках. Это однородное средство с высоким содержанием in-situ, совместимое с физиологическими образцами (клеточными лизатами, кровью и т. д.).

FCS широко используется в передаче сигналов в клетках, разделении фаз жидкость-жидкость, биомолекулярной денатурации и агрегации, структурно-функциональных механизмах, разработке наномедицины, анализе экзосом, разработке флуоресцентных зондов, скрининге антител и лекарств, а также микрофлюидике. Более 15 000 публикаций в PubMed посвящены FCS и производным от него технологиям.