تحليل جزيء واحد FCS يساعد فريق IGDB في الكشف عن ديناميات تعزيز البوليمر للزيلان

الزيلان هو ثاني أكثر السكريات وفرة في جدران الخلايا النباتية بعد السليلوز ، ويلعب أدوار حاسمة في الحفاظ على سلامة جدار الخلية والقوة الميكانيكية وقساوة الكتلة الحيوية.يعتمد تكوينها الحيوي على معقد متعدد الإنزيمات المعروف باسم معقد سينتاز الزيلان (XSC)ومع ذلك، فإن المكونات الأساسية والآليات البيوكيميائية لـ XSC لا تزال غير معروفة إلى حد كبير.معهد علم الوراثة وعلم الأحياء التنموي، الأكاديمية الصينية للعلوم (IGDB، CAS)نشرت دراسة فيخلية النباتيحق لهيُعزّز XYLAN O-ACETYLTRANSFERASE 6 تخليق الزيلان عن طريق تشكيل مجمع مع IRX10 ويحكم تكوين الجدار في الأرز.

هذه الدراسة حددتزيلان أوكسيتيلترانسفيراز 6 (XOAT6)وIRX10 (صناعة الكسيلان)كمكونات أساسية لـ XSCs ، تشكل الوحدة الأساسية الوظيفية للمجمع.أظهرت النتائج أن XOAT6 لا يقتصر فقط على استحداث أسيتيل في العمود الفقري للزيلان ولكن أيضاً يعزز بشكل مباشر نشاط البوليمراز في IRX10معًا، يقومون بتوليف الزيلان المُستقيم بشكل منسق وفعال. لأول مرة على المستوى الجزيئي، يكشف هذا العمل عن الآليات الكامنة وراء سلسلة الزيلانالتمددوتعديل، مما يوفر أساسًا نظريًا للهندسة الجدار الخلوي، وتربية المحاصيل عالية الإنتاجية عالية الجودة، وتطوير طاقة الكتلة الحيوية الفعالة.

افترضت الدراسة أن XOAT6 لا يعمل فقط كأسيتيل ترانسفيراز ولكن أيضاً يعزز بشكل مباشر البوليمرة العمودية للزيلان عن طريق تشكيل مجمع مع IRX10.طيف التشابك الفلورسنت (FCS)استخدمت لمتابعة التغيرات الحركية في الوقت الحقيقي أثناء البوليمرزة، بهدف استكشاف ما إذا كان XOAT6 يؤثر وكيف نشاط IRX10 البوليمراز في ظل ظروف محلول شبه الفسيولوجية.

كجليكوسيل ترانسفيراز، IRX10 تعمل عن طريق إضافة وحدات كسيليول جديدة (المتبرع) إلى نهاية سلسلة كسيلان موجودة (المقبل).الكسيلوبوز (X2)استخدمت كمستقبل أولي، وUDP-xyloseكجزء من الركيزة المانحة

تم وضع علامة على X2 بالصبغة الفلورسنتيةاليكسا فلور 488تم قياس نصف قطر هيدروديناميكي (RH) للجزيئات الملصقة بالفلورسنت عن طريق وظيفة الارتباط الذاتي للتتبع الديناميكي ، مما يعكس امتداد سلسلة الزيلان في الوقت الحقيقي.

• مجموعات التحكم: معلّم بـ X2 + المانح فقط؛ أو معلّم بـ X2 + إنزيم (بدون المانح).
• المجموعات التجريبية: IRX10 + الجهاز المانح + علامة X2 IRX10 + XOAT6 + الجهاز المانح + علامة X2

• XOAT6 يعزز بقوة البوليمرة: عندما كان كل من IRX10 و XOAT6 موجودين ، كان التغيير في RH أكثر أهمية بكثير من IRX10 وحده ، مما يشير إلى أن XOAT6 يزيد من نشاط البوليمراز IRX10 (الشكل 4C).
• تغيرات RH تنشأ من البوليمرة: لم تظهر تجارب التحكم أي تحول في RH عندما كانت التفاعلات تحتوي فقط على الركيزة المانحة (UDP-Xyl) و X2 المسمى AF488 ، أو فقط الإنزيم و X2 المسمى دون مانح (الشكل 4C).هذا يؤكد أن تغيرات RH هي نتيجة خاصة للبوليمرة من UDP-Xyl على AF488.
• مراقبة البوليمرزة الزيلانية في الوقت الحقيقي: أظهرت القياسات المستمرة أيضا أن معدل زيادة RH تضاعف تقريبا عندما عمل IRX10 و XOAT6 معا،يثبت مباشرة تعزيزهم التآزري لامتداد سلسلة الزيلان وتحسين كفاءة البوليمرة بشكل ملحوظ على المستوى الجزيئي (الشكل 4D).

الشكل 4التحقق من صحة التفاعلات الجزيئية بين XOAT6، IRX10، وبدوناتها. (أ) اختبار MST: صلة الارتباط (Kd) لـ XOAT6 ومتغيراتها مع IRX10 المسجلة. (B?? D) اختبارات FCS:تم استخدام الكسيلوبيز المسمّى AF488 لمراقبة التغيرات في RH في الوقت الحقيقي، تعكس إطالة سلسلة الزيلان.

في هذه الدراسة، تم استخدام طيف التشابك الفلوريسنت (FCS) لمراقبة التغيرات الديناميكية أثناء تعدين الزيلان في الوقت الحقيقي فيمستوى جزيء واحد، تظهر نقاط قوة واضحة خاصة في وصف كيفية تعزيز مجمع IRX10 XOAT6 إطالة سلسلة الزيلان:

• الرصد الديناميكي في الوقت الحقيقي للجزيء الواحد: يكتشف نظام FCS سلوك الانتشار للجزيئات الفردية الموصوفة بالفلوروسنت في تركيزات منخفضة للغاية (pM ‬nM) ، مما يسمح بتتبع التغيرات في نصف قطرها الهيدروديناميكي في الوقت الحقيقي أثناء البوليمرة.على النقيض، والطرق التقليدية مثل طيف الكتلة والتحليل الكهربائي تحلل فقط منتجات النقطة النهائية ولا يمكن أن توفر بيانات ديناميكية في الوقت المناسب.
• في محلول، الكشف الأصلي: يتم إجراء الاختبارات في محلول متجانس في ظروف فيزيولوجية تقريبًا ، دون إيقاف العينة أو تعطيل تكوينات البروتين الأصلية.المجهر الإلكتروني والرنين المغناطيسي يتطلب إثبات أو تجفيف، والتي قد تغير الحالة الأصلية لمجمعات البروتين.

تكشف هذه الدراسة للمرة الأولى عن الدور المركزي لمجمع IRX10XOAT6 في عملية تخليق الأرز.وخصائص الكتلة الحيوية من خلال التحفيز المنسق والتنظيم الهيكلي عبر الآلية الجزيئيةوتوفّر هذه النتائج أساسًا نظريًا مهمًا ودعمًا تقنيًا لتحسين الوراثة النباتية، واستخدام الكتلة الحيوية بكفاءة،وبيولوجيا جدار الخلايا النباتية.

تم تطبيق نظام FCS لأول مرة على عملية تجميل الحيوي لبوليساكاريد جدار الخلايا النباتية ، مما يتجاوز قيود الطرق التقليدية.في الوقت الفعلي، التصور الديناميكي للجزيء الواحد والكميةمن التفاعلات الجزيئية الحيوية والتفاعلات الإنزيمية في محلول في ظروف فيزيولوجية تقريبًا ، مما يضع نموذجًا جديدًا لدراسة آليات تخليق هذه الجزيئات الكبرى.تقنية قوية لمراقبة الديناميكية الحيوية الجزيئية في الوقت الحقيقي على مستوى جزيء واحد في محلول، يحتوي FCS على وعود واسعة، وخاصة للعمليات البيولوجية الديناميكية، وتطوير الأدوية، والتكنولوجيا النانوية،ومن المتوقع أن تدفع أبحاث علوم الحياة من التحليل الهيكلي الثابت نحو تنظيم دقيق للعمليات الديناميكية.

الرابط الأصلي:https://doi.org/10.1093/plcell/koae322

يقيّم طيف التشابك الفلوري (FCS) كميّاً خصائص الجسيمات/الجسيمات النانوية، بما في ذلك التركيز الموليّ، ووضوح الفلوري/حالة التجميع.معامل الانتشار / نصف قطر هيدروديناميكي، وعلاقة التفاعل (KD) ‬ عند دقة جزيء واحد في عينات محلول على نطاق ميكرو لتر أو خلايا حية واحدة.أداة عالية المحتوى متوافقة مع العينات الفسيولوجية، الدم، الخ).

وقد استخدمت FCS على نطاق واسع في إشارة الخلايا، وفصل المرحلة السائلة، والتنحية الجزيئية الحيوية والتجميع، والآليات الهيكلية الوظيفية، وتطوير الطب النانوي، وتحليل الجسم الخارجي،هندسة المسبار الفلورسنت، فحص الأجسام المضادة والأدوية ، والميروفلوديكس. أكثر من 15،000 منشور في PubMed يصف FCS وتقنياتها المشتقة.