L'analizzatore mono-molecolare FCS aiuta il team dell'IGDB a rivelare la dinamica della polimerizzazione dello xilano

Lo xilano è il secondo polisaccaride più abbondante nelle pareti cellulari delle piante dopo la cellulosa e svolge ruoli critici nel mantenimento dell'integrità delle pareti cellulari, della resistenza meccanica e della recalcitranza della biomassa.La sua biosintesi si basa su un complesso multienzimico noto come complesso xilanosintasi (XSC)Tuttavia, i componenti fondamentali e i meccanismi biochimici dell'XSC rimangono in gran parte sconosciuti.Istituto di genetica e biologia dello sviluppo, Accademia cinese delle scienze (IGDB, CAS)La Commissione ha pubblicato uno studio inLa cellula della piantacon dirittoXYLAN O-ACETYLTRANSFERASE 6 promuove la sintesi dello xilano formando un complesso con IRX10 e regola la formazione di pareti nel riso.

Questo studio ha identificatoXYLAN O-ACETYLTRANSFERASE 6 (XOAT6)- eIRX10 (una xilanosintasi)come componenti fondamentali di XSC, che formano il modulo funzionale del complesso.I risultati hanno dimostrato che XOAT6 non solo acetilizza la spina dorsale dello xilano, ma aumenta anche direttamente l' attività della polimerasi di IRX10.Per la prima volta a livello molecolare, questo lavoro rivela i meccanismi alla base della catena del xilano.allungamento- emodificazione, che fornisce una base teorica per la progettazione delle pareti cellulari, la coltivazione di colture di alto rendimento e di alta qualità e lo sviluppo di un'efficiente energia da biomassa.

Lo studio ha ipotizzato che XOAT6 agisca non solo come acetiltransferasi, ma promuova anche direttamente la polimerizzazione (allungamento) della spina dorsale dello xilano formando un complesso con IRX10.Spectroscopia di correlazione di fluorescenza (FCS)L' esperimento è stato utilizzato per monitorare in tempo reale i cambiamenti cinetici durante la polimerizzazione, con l' obiettivo di esplorare se e come XOAT6 influenza l' attività della polimerasi IRX10 in condizioni di soluzione quasi fisiologiche.

Come glicosiltransferasi, IRX10 funziona aggiungendo nuove unità xilosili (donatori) alla fine di una catena xilanica esistente (accettori).xilobiosio (X2)è stato utilizzato come accettore iniziale, eUDP-xilosiocome substrato donatore.

X2 era etichettato con il colorante fluorescenteAlexa Fluoro 488(Figura 4B) Il raggio idrodinamico (RH) delle molecole etichettate a fluorescenza è stato misurato tramite funzione di autocorrelazione per il tracciamento dinamico, riflettendo l'allungamento della catena di xilano in tempo reale.

• Gruppi di controllo: etichettato solo come X2 + donatore; o etichettato come X2 + enzima (senza donatore).
• Gruppi sperimentali: IRX10 + donatore + etichettato X2 IRX10 + XOAT6 + donatore + etichettato X2

• XOAT6 favorisce fortemente la polimerizzazione: Quando erano presenti sia IRX10 che XOAT6, il cambiamento nella RH era molto più significativo che con IRX10 da solo, indicando che XOAT6 aumenta l' attività della polimerasi di IRX10 (Figura 4C).
• I cambiamenti della RH derivano dalla polimerizzazione: Gli esperimenti di controllo non hanno mostrato alcun cambiamento di RH quando le reazioni contenevano solo il substrato donatore (UDP-Xyl) e X2 etichettato AF488, o solo l'enzima e X2 etichettato senza donatore (Figura 4C).Ciò conferma che i cambiamenti della Rh sono il risultato specifico della polimerizzazione di UDP-Xyl su X2 etichettato AF488..
• Monitoraggio in tempo reale della polimerizzazione dello xilano: Le misurazioni continue hanno inoltre rivelato che il tasso di aumento della RH è raddoppiato approssimativamente quando IRX10 e XOAT6 hanno agito insieme,dimostrando direttamente la loro promozione sinergica dell'allungamento della catena dello xilano e un notevole miglioramento dell'efficienza della polimerizzazione a livello molecolare (figura 4D).

Figura 4Validazione delle interazioni molecolari tra XOAT6, IRX10 e i loro substrati. (A) Assaggio MST: affinità di legame (Kd) di XOAT6 e dei suoi mutanti con IRX10 etichettato. (B ∆ D) Assaggi FCS:Xylobiose etichettata AF488 è stata utilizzata per monitorare le variazioni dell' Rh in tempo reale., che riflette l'allungamento della catena di xilano.

In questo studio, la spettroscopia di correlazione di fluorescenza (FCS) è stata utilizzata per osservare in tempo reale i cambiamenti dinamici durante la polimerizzazione dello xilano al livello dilivello di singola molecola, mostrando chiari punti di forza soprattutto nella caratterizzazione di come il complesso IRX10 XOAT6 promuove l'allungamento della catena di xilano:

• Monitoraggio dinamico in tempo reale di una singola molecola: FCS rileva il comportamento di diffusione di singole molecole etichettate in modo fluorescente a concentrazioni ultra-basse (pM·nM), consentendo il monitoraggio in tempo reale dei cambiamenti del raggio idrodinamico durante la polimerizzazione.In contrasto, i metodi tradizionali come la spettrometria di massa e l'elettroforesi analizzano solo i prodotti del punto finale e non possono fornire dati dinamici con risoluzione temporale.
• In-soluzione, rilevazione nativa: Gli esami sono eseguiti in soluzione omogenea in condizioni quasi fisiologiche, senza immobilizzazione del campione o interruzione delle conformazioni proteiche native.La microscopia elettronica e la risonanza magnetica richiedono la fissazione o l'essiccazione, che può alterare lo stato nativo dei complessi proteici.

Questo studio rivela, per la prima volta, il ruolo centrale del complesso IRX10XOAT6 nella biosintesi del xilano di riso.e proprietà della biomassa attraverso la catalisi coordinata e la regolazione strutturale attraverso il meccanismo molecolareQuesti risultati forniscono un importante fondamento teorico e un supporto tecnico per il miglioramento genetico delle colture, l'utilizzo efficiente della biomassa, la ricerca e la ricerca scientifica.e biologia delle pareti cellulari delle piante.

Il FCS è stato applicato per la prima volta alla biosintesi dei polisaccaridi della parete cellulare vegetale, superando i limiti dei metodi convenzionali.visualizzazione e quantificazione dinamica in tempo reale di una singola molecolaIn particolare, la ricerca sulle interazioni biomolecolari e sulle reazioni enzimatiche in soluzione in condizioni quasi fisiologiche, stabilisce un nuovo paradigma per lo studio dei meccanismi di sintesi di tali macromolecole.Come potente tecnica per il monitoraggio in tempo reale della dinamica biomolecolare a livello di singola molecola in soluzione, la FCS è molto promettente, in particolare per i processi biologici dinamici, lo sviluppo di farmaci e la nanotecnologia,e dovrebbe guidare la ricerca delle scienze della vita dall'analisi strutturale statica verso una precisa regolazione dei processi dinamici.

Link originale:Il presente regolamento entra in vigore il giorno successivo alla pubblicazione nella Gazzetta ufficiale dell'UE.

La spettroscopia di correlazione di fluorescenza (FCS) misura quantitativamente le proprietà molecolari/nanoparticelle, inclusa la concentrazione molare, la luminosità/lo stato di aggregazione della fluorescenza,coefficiente di diffusione/raggio idrodinamico, e affinità di interazione (KD) ∆ a risoluzione singola molecola in campioni di soluzione su scala di microlitri o singole cellule viventi.strumento ad alto contenuto compatibile con campioni fisiologici (lisati cellulari), sangue, ecc.).

La FCS è stata ampiamente utilizzata nella segnalazione cellulare, nella separazione della fase liquida/liquida, nella denaturazione e nell'aggregazione biomolecolare, nei meccanismi di struttura/funzione, nello sviluppo della nanomedicina, nell'analisi degli esosomi,ingegneria delle sonde fluorescentiPiù di 15.000 pubblicazioni su PubMed parlano di FCS e delle sue tecnologie derivate.