L'analizzatore mono-molecolare FCS aiuta il team dell'IGDB a rivelare la dinamica della polimerizzazione dello xilano

Lo xilano è il secondo polisaccaride più abbondante nelle pareti cellulari delle piante dopo la cellulosa e svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'integrità della parete cellulare, della resistenza meccanica e della recalcitranza della biomassa. La sua biosintesi si basa su un complesso multienzimatico noto come complesso xilano sintasi (XSC). Tuttavia, i componenti principali e i meccanismi biochimici dell’XSC rimangono in gran parte sconosciuti. Recentemente, un gruppo di ricerca guidato da Baocai Zhang delIstituto di genetica e biologia dello sviluppo, Accademia cinese delle scienze (IGDB, CAS)ha pubblicato uno studio inLa cellula vegetaleintitolatoXYLAN O-ACETYLTRANSFERASE 6 promuove la sintesi di xilano formando un complesso con IRX10 e governa la formazione della parete nel riso.

Questo studio ha identificatoXYLAN O-ACETILTRANSFERASI 6 (XOAT6)EIRX10 (una xilano sintasi)come componenti principali degli XSC, formando il modulo principale funzionale del complesso. I risultati hanno dimostrato che XOAT6 non solo acetila la struttura dello xilano, ma migliora anche direttamente l'attività della polimerasi di IRX10. Insieme, sintetizzano in modo coordinato ed efficiente lo xilano acetilato. Per la prima volta a livello molecolare, questo lavoro rivela i meccanismi alla base della catena xilanicaallungamentoEmodifica, fornendo una base teorica per l'ingegneria delle pareti cellulari, la selezione di colture ad alto rendimento e di alta qualità e lo sviluppo di energia da biomassa efficiente.

Lo studio ha ipotizzato che XOAT6 agisca non solo come acetiltransferasi ma promuova anche direttamente la polimerizzazione della struttura portante (allungamento) dello xilano formando un complesso con IRX10. Per testare questo,Spettroscopia di correlazione della fluorescenza (FCS)è stato utilizzato per monitorare i cambiamenti cinetici in tempo reale durante la polimerizzazione, con l'obiettivo di esplorare se e come XOAT6 influenza l'attività della polimerasi IRX10 in condizioni di soluzione quasi fisiologiche.

Come glicosiltransferasi, IRX10 funziona aggiungendo nuove unità xilosile (donatore) all'estremità di una catena xilanica esistente (accettore). In questo studio,xilobiosio (X2)è stato utilizzato come accettore iniziale, eUDP-xilosiocome substrato donatore.

X2 è stato etichettato con il colorante fluorescenteAlexa Fluor 488(Figura 4B). Il raggio idrodinamico (RH) delle molecole marcate con fluorescenza è stato misurato tramite la funzione di autocorrelazione per il tracciamento dinamico, riflettendo l'allungamento della catena di xilano in tempo reale.

• Gruppi di controllo: Etichettato X2 + solo donatore; o etichettato X2 + enzima (senza donatore).
• Gruppi sperimentali: IRX10 + donatore + etichettato X2 IRX10 + XOAT6 + donatore + etichettato X2

• XOAT6 promuove fortemente la polimerizzazione: Quando erano presenti sia IRX10 che XOAT6, la variazione dell'umidità relativa era molto più significativa rispetto al solo IRX10, indicando che XOAT6 migliora l'attività della polimerasi di IRX10 (Figura 4C).
• I cambiamenti di umidità relativa derivano dalla polimerizzazione: Gli esperimenti di controllo non hanno mostrato alcuno spostamento dell'RH quando le reazioni contenevano solo substrato donatore (UDP-Xyl) e X2 etichettato con AF488, o solo enzima ed etichettato X2 senza donatore (Figura 4C). Ciò conferma che i cambiamenti di RH derivano specificamente dalla polimerizzazione di UDP-Xyl su X2 marcato con AF488.
• Monitoraggio in tempo reale della polimerizzazione dello xilano: Misurazioni continue hanno inoltre rivelato che il tasso di aumento dell'umidità relativa è quasi raddoppiato quando IRX10 e XOAT6 hanno agito insieme, dimostrando direttamente la loro promozione sinergica dell'allungamento della catena xilanica e un'efficienza di polimerizzazione notevolmente migliorata a livello molecolare (Figura 4D).

Figura 4Validazione delle interazioni molecolari tra XOAT6, IRX10 e i loro substrati. (A) Analisi MST: affinità di legame (Kd) di XOAT6 e dei suoi mutanti con IRX10 marcato. (B-D) Saggi FCS: lo xilobiosio marcato con AF488 è stato utilizzato per monitorare i cambiamenti nell'umidità relativa in tempo reale, riflettendo l'allungamento della catena di xilano.

In questo studio, la spettroscopia di correlazione della fluorescenza (FCS) è stata utilizzata per osservare i cambiamenti dinamici durante la polimerizzazione dello xilano in tempo realelivello di singola molecola, mostrando chiari punti di forza soprattutto nel caratterizzare il modo in cui il complesso IRX10-XOAT6 promuove l'allungamento della catena xilanica:

• Monitoraggio dinamico in tempo reale di una singola molecola: FCS rileva il comportamento di diffusione di singole molecole marcate con fluorescenza a concentrazioni ultrabasse (pM–nM), consentendo il monitoraggio in tempo reale dei cambiamenti del raggio idrodinamico durante la polimerizzazione. Al contrario, i metodi tradizionali come la spettrometria di massa e l’elettroforesi analizzano solo i prodotti del punto finale e non possono fornire dati dinamici risolti nel tempo.
• Rilevamento nativo nella soluzione: I test vengono eseguiti in soluzione omogenea in condizioni quasi fisiologiche, senza immobilizzazione del campione o interruzione delle conformazioni delle proteine ​​native. La microscopia elettronica e la NMR richiedono fissazione o essiccazione, che possono alterare lo stato nativo dei complessi proteici.

Questo studio rivela, per la prima volta, il ruolo centrale del complesso IRX10-XOAT6 nella biosintesi dello xilano del riso. Chiarisce sistematicamente come questo complesso influenza la crescita delle piante, lo sviluppo e le proprietà della biomassa attraverso la catalisi coordinata e la regolazione strutturale attraverso il meccanismo molecolare, l'architettura della parete cellulare e la biomeccanica. Questi risultati forniscono un’importante base teorica e un supporto tecnico per il miglioramento genetico delle colture, l’utilizzo efficiente della biomassa e la biologia della parete cellulare delle piante.

La FCS è stata applicata per la prima volta alla biosintesi dei polisaccaridi della parete cellulare delle piante, superando le limitazioni dei metodi convenzionali. Abilitavisualizzazione e quantificazione dinamica di singole molecole in tempo realedi interazioni biomolecolari e reazioni enzimatiche in soluzione in condizioni quasi fisiologiche, stabilendo un nuovo paradigma per lo studio dei meccanismi di sintesi di tali macromolecole. Essendo una potente tecnica per il monitoraggio in tempo reale delle dinamiche biomolecolari a livello di singola molecola in soluzione, la FCS è molto promettente, in particolare per i processi biologici dinamici, lo sviluppo di farmaci e le nanotecnologie, e si prevede che guiderà la ricerca nelle scienze della vita dall'analisi strutturale statica verso una regolazione precisa dei processi dinamici.

Collegamento originale:https://doi.org/10.1093/plcell/koae322

La spettroscopia di correlazione della fluorescenza (FCS) misura quantitativamente le proprietà molecolari/nanoparticellari, tra cui concentrazione molare, luminosità della fluorescenza/stato di aggregazione, coefficiente di diffusione/raggio idrodinamico e affinità di interazione (KD), con risoluzione di singola molecola in campioni di soluzione su scala di microlitri o singole cellule viventi. È uno strumento in situ, omogeneo, ad alto contenuto compatibile con campioni fisiologici (lisati cellulari, sangue, ecc.).

La FCS è stata ampiamente utilizzata nella segnalazione cellulare, nella separazione di fase liquido-liquido, nella denaturazione e aggregazione biomolecolare, nei meccanismi struttura-funzione, nello sviluppo di nanomedicina, nell'analisi degli esosomi, nell'ingegneria di sonde fluorescenti, nello screening di anticorpi e farmaci e nella microfluidica. Oltre 15.000 pubblicazioni su PubMed riguardano FCS e le sue tecnologie derivate.