FCS Single-Molecule Analyzer Aids IGDB Team em Revealing Xylan Polymerization Dynamics

Xylan é o segundo polissacarídeo mais abundante nas paredes celulares das plantas, depois da celulose, e desempenha papéis críticos na manutenção da integridade da parede celular, resistência mecânica e recalcitrância da biomassa. Sua biossíntese depende de um complexo multienzimático conhecido como complexo xilano sintase (XSC). No entanto, os principais componentes e mecanismos bioquímicos do XSC permanecem em grande parte desconhecidos. Recentemente, uma equipe de pesquisa liderada por Baocai Zhang doInstituto de Genética e Biologia do Desenvolvimento, Academia Chinesa de Ciências (IGDB, CAS)publicou um estudo emA célula vegetalintituladoA XILANA O-ACETILTRANSFERASE 6 promove a síntese de xilana formando um complexo com IRX10 e governa a formação da parede no arroz.

Este estudo identificouXILANO O-ACETILTRANSFERASE 6 (XOAT6)eIRX10 (uma xilana sintase)como componentes principais dos XSCs, formando o módulo central funcional do complexo. Os resultados demonstraram que o XOAT6 não apenas acetila a estrutura da xilana, mas também aumenta diretamente a atividade da polimerase do IRX10. Juntos, eles sintetizam de forma coordenada e eficiente a xilana acetilada. Pela primeira vez a nível molecular, este trabalho revela os mecanismos subjacentes à cadeia xilanaalongamentoemodificação, fornecendo uma base teórica para a engenharia da parede celular, o cultivo de culturas de alto rendimento e de alta qualidade e o desenvolvimento de energia de biomassa eficiente.

O estudo levantou a hipótese de que o XOAT6 atua não apenas como uma acetiltransferase, mas também promove diretamente a polimerização da estrutura (alongamento) da xilana, formando um complexo com o IRX10. Para testar isso,Espectroscopia de Correlação de Fluorescência (FCS)foi usado para monitorar mudanças cinéticas em tempo real durante a polimerização, com o objetivo de explorar se e como o XOAT6 influencia a atividade da polimerase IRX10 sob condições de solução quase fisiológicas.

Como uma glicosiltransferase, o IRX10 funciona adicionando novas unidades de xilosil (doador) ao final de uma cadeia de xilana existente (aceitador). Neste estudo,xilobiose (X2)foi usado como aceitador inicial eUDP-xilosecomo substrato doador.

X2 foi marcado com o corante fluorescenteAlexa Flúor 488(Figura 4B). O raio hidrodinâmico (UR) de moléculas marcadas com fluorescência foi medido através da função de autocorrelação para rastreamento dinâmico, refletindo o alongamento da cadeia de xilana em tempo real.

• Grupos de controle: Rotulado X2 + apenas doador; ou enzima X2 + rotulada (sem doador).
• Grupos experimentais: IRX10 + doador + rotulado X2 IRX10 + XOAT6 + doador + rotulado X2

• XOAT6 promove fortemente a polimerização: Quando tanto o IRX10 quanto o XOAT6 estavam presentes, a alteração na UR foi muito mais significativa do que com o IRX10 sozinho, indicando que o XOAT6 aumenta a atividade da polimerase do IRX10 (Figura 4C).
• Mudanças de RH surgem da polimerização: Experimentos de controle não mostraram mudança de RH quando as reações continham apenas substrato doador (UDP-Xyl) e X2 marcado com AF488, ou apenas enzima e marcado X2 sem doador (Figura 4C). Isto confirma que as alterações de RH resultam especificamente da polimerização de UDP-Xyl em X2 marcado com AF488.
• Monitoramento em tempo real da polimerização de xilana: Medições contínuas revelaram ainda que a taxa de aumento de UR aproximadamente dobrou quando IRX10 e XOAT6 agiram juntos, provando diretamente sua promoção sinérgica do alongamento da cadeia de xilana e eficiência de polimerização marcadamente melhorada em nível molecular (Figura 4D).

Figura 4Validação de interações moleculares entre XOAT6, IRX10 e seus substratos. (A) Ensaio MST: Afinidade de ligação (Kd) de XOAT6 e seus mutantes ao IRX10 marcado. (B – D) Ensaios FCS: xilobiose marcada com AF488 foi usada para monitorar mudanças na UR em tempo real, refletindo o alongamento da cadeia de xilana.

Neste estudo, a Espectroscopia de Correlação de Fluorescência (FCS) foi utilizada para observar mudanças dinâmicas durante a polimerização da xilana em tempo real nonível de molécula única, mostrando pontos fortes claros, especialmente na caracterização de como o complexo IRX10 – XOAT6 promove o alongamento da cadeia de xilana:

• Monitoramento dinâmico em tempo real de molécula única: O FCS detecta o comportamento de difusão de moléculas individuais marcadas com fluorescência em concentrações ultrabaixas (pM – nM), permitindo o rastreamento em tempo real das alterações do raio hidrodinâmico durante a polimerização. Em contraste, os métodos tradicionais, como espectrometria de massa e eletroforese, analisam apenas produtos finais e não podem fornecer dados dinâmicos resolvidos no tempo.
• Detecção nativa na solução: Os ensaios são realizados em solução homogênea sob condições quase fisiológicas, sem imobilização da amostra ou ruptura das conformações da proteína nativa. A microscopia eletrônica e a RMN requerem fixação ou secagem, o que pode alterar o estado nativo dos complexos proteicos.

Este estudo revela, pela primeira vez, o papel central do complexo IRX10 – XOAT6 na biossíntese de xilana do arroz. Ele elucida sistematicamente como esse complexo afeta o crescimento, o desenvolvimento e as propriedades da biomassa das plantas por meio de catálise coordenada e regulação estrutural através do mecanismo molecular, arquitetura da parede celular e biomecânica. Essas descobertas fornecem uma importante base teórica e suporte técnico para o melhoramento genético das culturas, a utilização eficiente da biomassa e a biologia da parede celular das plantas.

O FCS foi aplicado pela primeira vez à biossíntese de polissacarídeos da parede celular vegetal, superando as limitações dos métodos convencionais. Ele permitevisualização e quantificação dinâmica de molécula única em tempo realde interações biomoleculares e reações enzimáticas em solução sob condições quase fisiológicas, estabelecendo um novo paradigma para o estudo dos mecanismos de síntese de tais macromoléculas. Como uma técnica poderosa para monitoramento em tempo real da dinâmica biomolecular no nível de molécula única em solução, o FCS é uma ampla promessa, especialmente para processos biológicos dinâmicos, desenvolvimento de medicamentos e nanotecnologia, e espera-se que conduza a pesquisa em ciências da vida, desde a análise estrutural estática até a regulação precisa de processos dinâmicos.

Link original:https://doi.org/10.1093/plcell/koae322

A espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS) mede quantitativamente as propriedades moleculares/nanopartículas — incluindo concentração molar, brilho de fluorescência/estado de agregação, coeficiente de difusão/raio hidrodinâmico e afinidade de interação (KD) — em resolução de molécula única em amostras de solução em escala de microlitro ou células vivas individuais. É uma ferramenta in situ, homogênea e de alto conteúdo compatível com amostras fisiológicas (lisados ​​celulares, sangue, etc.).

O FCS tem sido amplamente utilizado em sinalização celular, separação de fases líquido-líquido, desnaturação e agregação biomolecular, mecanismos de estrutura-função, desenvolvimento de nanomedicina, análise de exossomos, engenharia de sondas fluorescentes, triagem de anticorpos e drogas e microfluídica. Mais de 15.000 publicações no PubMed apresentam FCS e suas tecnologias derivadas.