FCS Single-Molecule Analyzer Aids IGDB Team em Revealing Xylan Polymerization Dynamics

O xilano é o segundo polissacarídeo mais abundante nas paredes celulares das plantas depois da celulose, e desempenha papéis críticos na manutenção da integridade da parede celular, resistência mecânica e recalcitrancia da biomassa.A sua biosíntese depende de um complexo multi-enzimático conhecido como complexo xilanossintase (XSC)No entanto, os componentes essenciais e os mecanismos bioquímicos do XSC permanecem em grande parte desconhecidos.Instituto de Genética e Biologia do Desenvolvimento, Academia Chinesa de Ciências (IGDB, CAS)publicou um estudo emA célula vegetalDireitoA XYLAN O-ACETYLTRANSFERASE 6 promove a síntese de xilano formando um complexo com IRX10 e regula a formação de parede no arroz.

Este estudo identificouXYLAN O-ACETYLTRANSFERASE 6 (XOAT6)eIRX10 (uma xilanosintase)como componentes essenciais dos XSCs, formando o módulo funcional do complexo.Os resultados demonstraram que o XOAT6 não só acetila a espinha dorsal do xilano, mas também aumenta diretamente a actividade da polimerase do IRX10.Em conjunto, sintetizam de forma coordenada e eficiente o xilano acetilado. Pela primeira vez a nível molecular, este trabalho revela os mecanismos subjacentes à cadeia do xilanoalongamentoemodificação, fornecendo uma base teórica para a engenharia das paredes celulares, o melhoramento de culturas de alto rendimento e de alta qualidade e o desenvolvimento de energia biomassa eficiente.

O estudo apresentou a hipótese de que o XOAT6 atua não apenas como uma acetiltransferase, mas também promove diretamente a polimerização da coluna vertebral (alongamento) do xilano, formando um complexo com o IRX10.Espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS)Foi utilizado para monitorizar alterações cinéticas em tempo real durante a polimerização, com o objectivo de explorar se e como o XOAT6 influencia a actividade da polimerase IRX10 em condições de solução quase fisiológicas.

Como glicosiltransferase, a IRX10 funciona adicionando novas unidades xilosílicas (doador) ao final de uma cadeia de xilano existente (aceitor).xilobiose (X2)foi utilizado como aceitador inicial, eUDP-xilosecomo substrato doador.

O X2 foi rotulado com o corante fluorescenteAlexa Fluor 488O raio hidrodinâmico (RH) das moléculas marcadas fluorescentemente foi medido através da função de autocorrelação para rastreamento dinâmico, refletindo o alongamento da cadeia de xilano em tempo real.

• Grupos de controlo: Marcado apenas como X2 + doador; ou marcado como X2 + enzima (sem doador).
• Grupos experimentais: IRX10 + doador + marcado X2 IRX10 + XOAT6 + doador + marcado X2

• O XOAT6 promove fortemente a polimerização: Quando tanto IRX10 como XOAT6 estavam presentes, a alteração na RH foi muito mais significativa do que com IRX10 isolado, indicando que o XOAT6 aumenta a atividade da polimerase do IRX10 (Figura 4C).
• Mudanças de RH resultam da polimerização: Os experimentos de controlo não revelaram qualquer alteração da Rh quando as reacções continham apenas substrato doador (UDP-Xyl) e X2 marcado com AF488, ou apenas enzima e X2 marcado sem doador (Figura 4C).Isto confirma que as alterações da Rh resultam especificamente da polimerização de UDP-Xyl em X2 marcado com AF488..
• Monitorização em tempo real da polimerização do xilano: As medições contínuas revelaram ainda que a taxa de aumento da RH duplicou aproximadamente quando IRX10 e XOAT6 agiram em conjunto,provando diretamente a sua promoção sinérgica do alongamento da cadeia de xilano e uma eficiência de polimerização significativamente melhorada a nível molecular (Figura 4D).

Figura 4Validação de interações moleculares entre XOAT6, IRX10 e seus substratos. (A) Ensaio MST: afinidade de ligação (Kd) de XOAT6 e seus mutantes com o IRX10 rotulado. (B?? D) Ensaio FCS:A xillobiose marcada com AF488 foi utilizada para monitorizar as alterações da RH em tempo real., refletindo o alongamento da cadeia de xilano.

Neste estudo, a Espectroscopia de Correlação de Fluorescência (FCS) foi utilizada para observar mudanças dinâmicas durante a polimerização do xilano em tempo real noNível de molécula única, mostrando pontos fortes claros, especialmente na caracterização de como o complexo IRX10XOAT6 promove o alongamento da cadeia de xilano:

• Monitorização dinâmica em tempo real de uma única molécula: O FCS detecta o comportamento de difusão de moléculas individuais marcadas fluorescentemente em concentrações ultra-baixas (pM·nM), permitindo o rastreamento em tempo real das alterações do raio hidrodinâmico durante a polimerização.Em contrasteOs métodos tradicionais, como a espectrometria de massa e a eletroforese, analisam apenas os produtos do ponto final e não podem fornecer dados dinâmicos com resolução temporal.
• Detecção nativa em solução: Os ensaios são realizados em solução homogénea, em condições quase fisiológicas, sem imobilização da amostra ou perturbação das conformações proteicas nativas.A microscopia eletrônica e a RMN requerem fixação ou secagem, o que pode alterar o estado nativo dos complexos proteicos.

O presente estudo revela, pela primeira vez, o papel central do complexo IRX10XOAT6 na biosíntese do xilano do arroz.e propriedades da biomassa através de catálise coordenada e regulação estrutural através do mecanismo molecularEstes resultados fornecem uma importante base teórica e suporte técnico para a melhoria genética das culturas, a utilização eficiente da biomassa, o desenvolvimento de novas tecnologias de produção e de produção de alimentos.e biologia da parede celular vegetal.

A FCS foi aplicada pela primeira vez à biosíntese de polissacarídeos da parede celular vegetal, ultrapassando as limitações dos métodos convencionais.Visualização e quantificação dinâmica de uma única molécula em tempo realO estudo das interacções biomoleculares e das reacções enzimáticas em solução em condições quase fisiológicas, estabelecendo um novo paradigma para o estudo dos mecanismos de síntese de tais macromoléculas.Como técnica poderosa para monitorização em tempo real da dinâmica biomolecular a nível de uma única molécula em solução, a FCS é muito promissora, especialmente para processos biológicos dinâmicos, desenvolvimento de medicamentos e nanotecnologia,e deverá conduzir a investigação das ciências da vida da análise estrutural estática para a regulação precisa dos processos dinâmicos.

Link original:O presente regulamento entra em vigor no dia seguinte ao da sua publicação no Jornal Oficial da União Europeia.

A espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS) mede quantitativamente as propriedades moleculares/nanopartículas, incluindo a concentração molar, o brilho da fluorescência/estado de agregação,coeficiente de difusão/rádio hidrodinâmico, e afinidade de interação (KD) ∆ à resolução de uma única molécula em amostras de solução em escala de microlitro ou células vivas individuais.ferramenta de alto teor compatível com amostras fisiológicas (lisatos celulares), sangue, etc.).

O FCS tem sido amplamente utilizado na sinalização celular, na separação de fase líquida/líquida, na desnaturação e agregação biomolecular, nos mecanismos de estrutura/função, no desenvolvimento de nanomedicina, na análise de exossomos,engenharia de sondas fluorescentesMais de 15 000 publicações no PubMed apresentam FCS e as suas tecnologias derivadas.