FCS Single-Molecule Analyzer helpt het IGDB-team bij het onthullen van de dynamiek van de Xylan-polymerisatie

Xylaan is na cellulose het meest voorkomende polysacharide in plantencelwanden en speelt een cruciale rol bij het handhaven van de celwandintegriteit, mechanische sterkte en weerspannigheid van de biomassa. De biosynthese is afhankelijk van een multi-enzymcomplex dat bekend staat als het xylaansynthasecomplex (XSC). De kerncomponenten en biochemische mechanismen van XSC blijven echter grotendeels onbekend. Onlangs heeft een onderzoeksteam onder leiding van Baocai Zhang van deInstituut voor Genetica en Ontwikkelingsbiologie, Chinese Academie van Wetenschappen (IGDB, CAS)publiceerde een studie inDe plantencelgerechtigdXYLAN O-ACETYLTRANSFERASE 6 bevordert de xylaansynthese door een complex te vormen met IRX10 en regelt de wandvorming in rijst.

Deze studie geïdentificeerdXYLAN O-ACETYLTRANSFERASE 6 (XOAT6)EnIRX10 (een xylaansynthase)als kerncomponenten van XSC's, die de functionele kernmodule van het complex vormen. De resultaten toonden aan dat XOAT6 niet alleen de xylan-skelet acetyleert, maar ook direct de polymerase-activiteit van IRX10 verbetert. Samen synthetiseren ze op gecoördineerde en efficiënte wijze geacetyleerd xylaan. Voor het eerst op moleculair niveau onthult dit werk de mechanismen die ten grondslag liggen aan de xylaanketenverlengingEnwijziging, dat een theoretische basis biedt voor celwandtechniek, het veredelen van gewassen met een hoge opbrengst en hoge kwaliteit, en de ontwikkeling van efficiënte biomassa-energie.

De studie veronderstelde dat XOAT6 niet alleen als een acetyltransferase werkt, maar ook direct de polymerisatie (rek) van xylan in de ruggengraat bevordert door een complex te vormen met IRX10. Om dit te testen,Fluorescentiecorrelatiespectroscopie (FCS)werd gebruikt om real-time kinetische veranderingen tijdens polymerisatie te volgen, met als doel te onderzoeken of en hoe XOAT6 de IRX10-polymerase-activiteit beïnvloedt onder vrijwel fysiologische oplossingsomstandigheden.

Als glycosyltransferase functioneert IRX10 door nieuwe xylosyleenheden (donor) toe te voegen aan het uiteinde van een bestaande xylaanketen (acceptor). In deze studiexylobiose (X2)werd gebruikt als de initiële acceptor, enUDP-xyloseals donorsubstraat.

X2 werd gelabeld met de fluorescerende kleurstofAlexa Fluor488(Figuur 4B). De hydrodynamische straal (RH) van fluorescent gelabelde moleculen werd gemeten via autocorrelatiefunctie voor dynamische tracking, wat de verlenging van de xylaanketen in realtime weerspiegelt.

• Controlegroepen: Alleen gelabeld X2 + donor; of gelabeld X2+-enzym (zonder donor).
• Experimentele groepen: IRX10 + donor + gelabeld X2 IRX10 + XOAT6 + donor + gelabeld X2

• XOAT6 bevordert de polymerisatie sterk: Wanneer zowel IRX10 als XOAT6 aanwezig waren, was de verandering in RH veel significanter dan bij IRX10 alleen, wat aangeeft dat XOAT6 de polymeraseactiviteit van IRX10 verbetert (Figuur 4C).
• RH-veranderingen komen voort uit polymerisatie: Controle-experimenten vertoonden geen RH-verschuiving wanneer reacties alleen donorsubstraat (UDP-Xyl) en AF488-gelabeld X2 bevatten, of alleen enzym en gelabeld X2 zonder donor (Figuur 4C). Dit bevestigt dat RH-veranderingen specifiek het gevolg zijn van polymerisatie van UDP-Xyl op AF488-gelabeld X2.
• Real-time monitoring van xylaanpolymerisatie: Continue metingen onthulden verder dat de snelheid van de RH-toename ongeveer verdubbelde wanneer IRX10 en XOAT6 samen werkten, wat direct hun synergetische bevordering van de verlenging van de xylaanketen bewees en een aanzienlijk verbeterde polymerisatie-efficiëntie op moleculair niveau (Figuur 4D).

Figuur 4Validatie van moleculaire interacties tussen XOAT6, IRX10 en hun substraten. (A) MST-test: bindingsaffiniteit (Kd) van XOAT6 en zijn mutanten voor gelabeld IRX10. (B – D) FCS-testen: AF488-gelabelde xylobiose werd gebruikt om veranderingen in de RH in realtime te volgen, wat de verlenging van de xylaanketen weerspiegelt.

In deze studie werd fluorescentiecorrelatiespectroscopie (FCS) gebruikt om dynamische veranderingen tijdens xylaanpolymerisatie in realtime te observeren op deniveau van één molecuul, wat duidelijke sterke punten laat zien, vooral bij het karakteriseren van hoe het IRX10-XOAT6-complex de verlenging van de xylaanketen bevordert:

• Real-time dynamische monitoring met één molecuul: FCS detecteert diffusiegedrag van individuele fluorescent gelabelde moleculen bij ultralage concentraties (pM – nM), waardoor real-time tracking van hydrodynamische straalveranderingen tijdens polymerisatie mogelijk wordt. Traditionele methoden zoals massaspectrometrie en elektroforese analyseren daarentegen alleen eindpuntproducten en kunnen geen tijdsopgeloste dynamische gegevens opleveren.
• In-oplossing, native detectie: Assays worden uitgevoerd in homogene oplossing onder vrijwel fysiologische omstandigheden, zonder monsterimmobilisatie of verstoring van natieve eiwitconformaties. Elektronenmicroscopie en NMR vereisen fixatie of droging, wat de oorspronkelijke staat van eiwitcomplexen kan veranderen.

Deze studie onthult voor het eerst de centrale rol van het IRX10-XOAT6-complex in de biosynthese van rijstxylaan. Het maakt systematisch duidelijk hoe dit complex de groei, ontwikkeling en biomassa-eigenschappen van planten beïnvloedt door gecoördineerde katalyse en structurele regulatie over moleculaire mechanismen, celwandarchitectuur en biomechanica. Deze bevindingen bieden een belangrijke theoretische basis en technische ondersteuning voor genetische verbetering van gewassen, efficiënt gebruik van biomassa en biologie van plantencelwanden.

FCS werd voor het eerst toegepast op de biosynthese van plantencelwandpolysachariden, waarmee de beperkingen van conventionele methoden werden overwonnen. Het maakt het mogelijkreal-time dynamische visualisatie en kwantificering van één molecuulvan biomoleculaire interacties en enzymatische reacties in oplossing onder bijna-fysiologische omstandigheden, waardoor een nieuw paradigma werd gecreëerd voor het bestuderen van de synthesemechanismen van dergelijke macromoleculen. Als een krachtige techniek voor real-time monitoring van de biomoleculaire dynamiek op het niveau van één molecuul in oplossing, houdt FCS een brede belofte in, vooral voor dynamische biologische processen, de ontwikkeling van geneesmiddelen en nanotechnologie, en zal naar verwachting het levenswetenschappelijk onderzoek stimuleren van statische structurele analyse naar nauwkeurige regulatie van dynamische processen.

Originele koppeling:https://doi.org/10.1093/plcell/koae322

Fluorescentiecorrelatiespectroscopie (FCS) meet kwantitatief de eigenschappen van moleculen/nanodeeltjes, waaronder de molaire concentratie, de helderheid/aggregatietoestand van de fluorescentie, de diffusiecoëfficiënt/hydrodynamische straal en de interactieaffiniteit (KD) bij een resolutie van één molecuul in oplossingsmonsters op microliterschaal of in afzonderlijke levende cellen. Het is een in-situ, homogeen hulpmiddel met een hoge inhoud dat compatibel is met fysiologische monsters (cellysaten, bloed, enz.).

FCS is op grote schaal gebruikt bij celsignalering, vloeistof-vloeistoffasescheiding, biomoleculaire denaturatie en aggregatie, structuur-functiemechanismen, ontwikkeling van nanogeneeskunde, exosoomanalyse, fluorescentiesonde-engineering, screening van antilichamen en geneesmiddelen, en microfluïdica. Meer dan 15.000 publicaties in PubMed gaan over FCS en de afgeleide technologieën ervan.