FCS Single-Molecule Analyzer helpt het IGDB-team bij het onthullen van de dynamiek van de Xylan-polymerisatie

Xylan is na cellulose het op een na meest voorkomende polysaccharide in de celwanden van planten en speelt een cruciale rol bij het handhaven van de celwanden, de mechanische sterkte en de weerstand tegen biomassa.De biosynthese ervan is gebaseerd op een multi-enzym complex dat bekend staat als het xylan synthase complex (XSC)De kerncomponenten en de biochemische mechanismen van XSC zijn echter nog grotendeels onbekend.Instituut voor Genetica en Ontwikkelingsbiologie, Chinese Academie van Wetenschappen (IGDB, CAS)De Commissie heeft een studie gepubliceerd inDe plantencelrecht heeftXYLAN O-ACETYLTRANSFERASE 6 bevordert de xylan synthese door een complex met IRX10 te vormen en regelt de vorming van de wand in rijst.

Deze studie identificeerdeXYLAN O-ACETYLTRANSFERASE 6 (XOAT6)enIRX10 (een xylan synthase)als kerncomponenten van XSC's, die de functionele kernmodule van het complex vormen.De resultaten toonden aan dat XOAT6 niet alleen de xylan ruggengraat acetyleert, maar ook rechtstreeks de polymerase-activiteit van IRX10 verhoogt.Het is voor het eerst op moleculair niveau dat in dit onderzoek de mechanismen worden onthuld die ten grondslag liggen aan de xylanketen.verlengingenwijzigingen, die een theoretische basis biedt voor celwandtechniek, het kweken van hoogopbrengende en hoogwaardige gewassen en het ontwikkelen van efficiënte biomassa-energie.

De studie veronderstelde dat XOAT6 niet alleen als acetyltransferase fungeert, maar ook rechtstreeks de ruggengraatpolymerisatie (verlenging) van xylan bevordert door een complex met IRX10 te vormen.Fluorescentiecorrelatiespectroscopie (FCS)werd gebruikt om realtime kinetische veranderingen tijdens de polymerisatie te controleren, met als doel te onderzoeken of en hoe XOAT6 de IRX10-polymeraseactiviteit beïnvloedt onder bijna fysiologische oplossingsomstandigheden.

Als glycosyltransferase functioneert IRX10 door het toevoegen van nieuwe xylosyl-eenheden (donor) aan het einde van een bestaande xylanketen (acceptor).xylobiose (X2)is gebruikt als initiële acceptor, enUDP-xyloseals donorsubstraat.

X2 was gemarkeerd met de fluorescerende kleurstofAlexa Fluor 488De hydrodynamische straal (RH) van fluorescerend gemerkte moleculen werd gemeten via autocorrelatiefunctie voor dynamische tracking, die de verlenging van de xylanketen in realtime weergeeft.

• Controlegroepen: Alleen met X2 + donor gemarkeerd; of met X2 + enzym gemarkeerd (zonder donor).
• Experimentele groepen: IRX10 + donor + gelabeld X2 IRX10 + XOAT6 + donor + gelabeld X2

• XOAT6 bevordert sterk de polymerisatie: Wanneer zowel IRX10 als XOAT6 aanwezig waren, was de verandering in RH veel significanter dan bij IRX10 alleen, wat aangeeft dat XOAT6 de polymerase-activiteit van IRX10 verhoogt (figuur 4C).
• RH-veranderingen ontstaan door polymerisatie: controlexperimenten toonden geen verschuiving van de Rh aan wanneer de reacties alleen donorsubstraat (UDP-Xyl) en AF488-gemerkte X2 bevatten, of alleen enzym en gemerkte X2 zonder donor (figuur 4C).Dit bevestigt dat RH-veranderingen specifiek het gevolg zijn van de polymerisatie van UDP-Xyl op AF488-gemerkte X2.
• Realtime monitoring van xylanpolymerisatie: continue metingen toonden verder aan dat de snelheid van RH-verhoging ongeveer verdubbelde wanneer IRX10 en XOAT6 samenwerkten,rechtstreeks bewijzen van hun synergetische bevordering van xylanketenverlenging en een duidelijk verbeterde polymerisatie-efficiëntie op moleculair niveau (figuur 4D).

Figuur 4Validering van moleculaire interacties tussen XOAT6, IRX10 en hun substraten. (A) MST-test: bindingsaffiniteit (Kd) van XOAT6 en zijn mutanten aan gemerkte IRX10. (B?? D) FCS-test:Xylobiose met AF488-label werd gebruikt om veranderingen in de RH in realtime te controleren., die de verlenging van de xylanketen weergeeft.

In dit onderzoek werd fluorescentiecorrelatiespectroscopie (FCS) gebruikt om dynamische veranderingen tijdens xylanpolymerisatie in realtime te observeren op deenkelmolecuulniveau, met duidelijke sterke punten, met name bij het karakteriseren van de manier waarop het IRX10XOAT6-complex de verlenging van de xylanketen bevordert:

• Dynamische real-time-monitoring van een enkel molecuul: FCS detecteert het diffusiegedrag van individuele fluorescerend gemarkeerde moleculen bij ultralage concentraties (pM·nM), waardoor hydrodynamische radiusveranderingen tijdens de polymerisatie in realtime kunnen worden gevolgd.In tegenstellingDe traditionele methoden zoals massa spectrometrie en elektroforese analyseren alleen eindprodukten en kunnen geen tijdopgeloste dynamische gegevens leveren.
• In-oplossing, native detectie: Tests worden uitgevoerd in een homogene oplossing onder bijna fysiologische omstandigheden, zonder immobilisatie van het monster of verstoring van de inheemse eiwitconformaties.Elektronenmicroscopie en NMR vereisen fixatie of drogen, die de natuurlijke toestand van eiwitcomplexen kunnen veranderen.

Deze studie onthult voor het eerst de centrale rol van het IRX10XOAT6-complex in de biosynthese van rijstxylan en toont systematisch aan hoe dit complex de groei, ontwikkeling en de ontwikkeling van planten beïnvloedt.en biomassa eigenschappen door gecoördineerde katalyse en structurele regulering over moleculair mechanismeDeze bevindingen bieden een belangrijke theoretische basis en technische ondersteuning voor de genetische verbetering van gewassen, het efficiënt gebruik van biomassa, de ontwikkeling van nieuwe technologieën en de ontwikkeling van nieuwe technologieën.en plantcelwandbiologie.

FCS werd voor het eerst toegepast op de biosynthese van plantaardige celwandpolysacchariden, waardoor de beperkingen van conventionele methoden werden overwonnen.real-time dynamische visualisatie en kwantificatie van een enkel molecuulHet onderzoek naar biomoleculaire interacties en enzymatische reacties in oplossing onder bijna fysiologische omstandigheden stelt een nieuw paradigma voor de studie van de synthese-mechanismen van dergelijke macromoleculen.Als een krachtige techniek voor realtime monitoring van de biomoleculaire dynamica op enkelmolecuulniveau in oplossing, FCS is veelbelovend, vooral voor dynamische biologische processen, geneesmiddelenontwikkeling en nanotechnologie,Het is de bedoeling dat het onderzoek in de levenswetenschappen van statische structurele analyse naar nauwkeurige regulering van dynamische processen zal leiden..

Oorspronkelijke link:De Commissie heeft de Commissie verzocht de volgende informatie te verstrekken:

Fluorescentiecorrelatiespectroscopie (FCS) meet kwantitatief moleculaire/nanodeeltjes eigenschappen, met inbegrip van molaire concentratie, fluorescentie helderheid/aggregatie toestand,diffusiescoëfficiënt/hydrodynamische straal, en interactie-affiniteit (KD) ∆ bij eenmoleculaire resolutie in microliterschaaloplossingsmonsters of enkele levende cellen.met een hoog gehalte aan gereedschap dat verenigbaar is met fysiologische monsters (cellysaten), bloed, enz.).

FCS is op grote schaal gebruikt in celsignalisatie, scheiding van vloeibare-vloeibare fasen, biomoleculaire denaturatie en aggregatie, structuur-functiemechanismen, ontwikkeling van nanomedicine, exosoomanalyse,fluorescerende sonde-techniekMeer dan 15.000 publicaties in PubMed hebben betrekking op FCS en afgeleide technologieën.