Анализ плавления высокого разрешения: декодирование генотипов из кривых тепловой диссоциации

Анализ высокого разрешения плавления (HRM) оценивает графические особенности кривых плавления продукта ДНК после ПЦР для выявления вариаций последовательности в нуклеиновых кислотах.Выявляя мельчайшие различия в последовательности, он позволяет различать виды нуклеиновых кислот для таких приложений, как сканирование мутаций, генотипирование и анализ метилирования.Анализируемые ампликоны могут впоследствии проходить характеристику ниже по течению с использованием гелевого электрофореза или секвенирования.Тем не менее, HRM требует системы количественной ПЦР в режиме реального времени с превосходной тепловой стабильностью и чувствительностью, а также специального программного обеспечения для анализа HRM.

Механизм HRM: от насыщения окрашивания до разрешения сигнала

Основной принцип заключается в наблюдении за изменениями флуоресценции в режиме реального времени, поскольку двойная нить ДНК (dsDNA) плавится в одно нить ДНК (ssDNA) при повышении температуры.создавая уникальную кривую плавленияДаже один нуклеотидный полиморфизм (SNP) незначительно изменяет стабильность ДНК, создавая отличительный, идентифицируемый профиль.

1. Усиление ПЦР: в реакционную смесь добавляют насыщенные флуоресцентные красители (например, красители третьего поколения, такие как EvaGreen или LCGreen).Эти красители излучают сильную флуоресценцию при связке с dsDNA и проявляют низкую флуоресценцию в их несвязанном состоянии.

2. Постепенная термическая диссоциация: после ПЦР прибор повышает температуру с низкой до высокой при чрезвычайно тонком термическом разрешении.вызывая снижение интенсивности флуоресценции и формирование кривой плавления (рисунок 1).

3. Анализ данных: вариации последовательности между образцами определяются различиями температуры плавления и формы кривой.Tmопределяется как температура, при которой 50% ДНК имеет двойные нити и 50% - одноцепочечные.и базовой комплементарности. Любое изменение одной базы вызывает тонкое изменениеTm.

Рисунок 1. Кривая сырого плавления, полученная платформой JLM-Lifetech HRM.Это иллюстрирует постепенное снижение относительных флуоресцентных единиц (RFU) по мере повышения температуры и высвобождения насыщенных красителей из дуплекса ДНКПри более низких температурах ДНК остается двойной нитью с обильным связыванием красителя, что дает высокую флуоресценцию.TmПри высоких температурах ДНК становится полностью одноцепочечной, снижая флуоресценцию до исходного уровня.Отличительные последовательности ДНК показывают незначительные изменения вTmФиолетовый: GG; Желтый: AA; Красный: Гетерозиготный.

Анализ HRM отличается от стандартного анализа кривой плавления в трех основных областях:

• Химическая система: HRM использует красители с более высокой концентрацией насыщения и более яркой флуоресценцией, такие как EvaGreen, LCGreen и SYTO9.

• Инструментация: HRM требует тепловых циклеров, способных получать тонкие данные с тепловым разрешением 0,02 ≈ 0,1 °C.

• Программное обеспечение: Управление персоналом основывается на передовом программном обеспечении, оснащенном сложными флуоресцентными алгоритмами и специализированными возможностями планирования.

При анализе HRM программное обеспечение автоматически нормализует необработанные сигналы флуоресценции до относительных значений 1,0 и 0 (рисунок 2),устранение базовых фоновых изменений и повышение чувствительности к незначительным различиям кривойИзменения последовательности определяются либо с изменением температуры, либо с изменением формы кривой.Гомозиготные аллели обычно появляются в виде горизонтальных температурных сдвигов вдоль оси х (фиолетовые и желтые кривые)Гетерозиготы характеризуются изменениями в форме кривой (красная кривая), вызванными более низкой тепловой устойчивостью несовместимых гетеродоплексов, образованных между диким типом и вариантом нитей.Чтобы сделать тонкие вариации легче визуализироватьДанные HRM часто отображаются в виде графиков различий, которые усиливают вариации относительно выбранного ориентира (рисунок 3).

Рисунок 2. Нормированная кривая плавления с платформы JLM-Lifetech HRM. Для устранения первоначальных колебаний интенсивности флуоресценции между образцамиПрограммное обеспечение нормализует сырые данные путем установки предварительного плавления флуоресценции на 1.0 и флуоресценции после плавления до 0. Это масштабирует все кривые равномерно, делая форму кривой иTmГомозиготы (дикий тип/мутант) проявляют горизонтальные сдвиги вдоль температурной осиTmсмещается направо, в то время как нижеTmГетерозиготы образуют несоответствующие гетеродуплексы, которые уменьшают стабильность, вызывая как смещение, так и деформацию формы (производя "плечо")..

Рисунок 3. Кривая разницы с платформы JLM-Lifetech HRM. Программное обеспечение определяет одну выборку в качестве базовой (обычно гомозигот дикого типа) и вычитает все другие нормализованные кривые из нее.Почти плоская линия различия указывает на идентичность последовательности с ссылкойАльтернативный гомозигот (например, мутирующий гомозигот) показывает общий сдвиг, приводящий к положительному или отрицательному пику.Поскольку гетерозиготные продукты ПЦР содержат нестабильные гетеродуплексы, их кривые значительно меняются, генерируя отличительные характерные вершины в форме "W-" или "M-" для простой идентификации.

Отношения между тремя графиками могут быть обобщены следующим образом: необработанные кривые проверяют общее присутствие; нормализованные кривые измеряют относительную величину сдвига;кривые различий показывают специфические дивергенции генотипов.

Три важнейших фактора для успешных экспериментов по управлению персоналом

HRM очень чувствителен к экспериментальным условиям.

• Насыщающие красители: требуются насыщенные красители третьего поколения (например, EvaGreen, LCGreen).Обычные красители, такие как SYBR Green, ингибируют ПЦР при высоких концентрациях и подвергаются "прыжению красителей" или перераспределению во время плавления при использовании в низких концентрациях, серьезно компрометируя разрешение.

• Короткие ампликоны: в идеале ампликоны должны быть< 100 bpдлинный, с38 ¢50 лКраткие фрагменты усиливаютTmсдвиг, вызванный изменениями одной базы.

• Стабильность прибора: системы qPCR высокого разрешения с отличной тепловой однородностью и чувствительностью необходимы в сочетании с специальным программным обеспечением HRM для обеспечения высокой плотности сбора данных.