86-400-600-8370 service@jlm-lifetech.com
Japanese
English Français Deutsch Italiano Русский Español Português Nederlandse 日本語 한국 中文 العربية
微信

High-Resolution Melting Analysis: Decoding Genotypes from Thermal Dissociation Curves

September 18, 2026
最近の会社ブログについて High-Resolution Melting Analysis: Decoding Genotypes from Thermal Dissociation Curves

高解像度メルトング (HRM) 解析は,PCR後製品DNAメルトング曲線のグラフィック特性を評価し,ヌクレイン酸の配列変異を特定する.微小な順序の違いを検出することで変異スキャン,ゲノタイプ化,メチル化分析などの用途で,核酸種を区別できます.分析されたアンプリカンは,その後ゲル電解または配列化を使用して下流特性化を受けることができます.しかし,HRMには,熱安定性や感度が優れたリアルタイムの定量PCRシステムと,専用のHRM分析ソフトウェアが必要です.

HRM の メカニズム: 飽和 染色 から 信号 解像 度 まで

基本原理は,二鎖DNA (dsDNA) が温度上昇時に単鎖DNA (ssDNA) に溶けていくとき,リアルタイムで発光変化をモニタリングすることです.独特の溶融曲線を生成する単一核酸多形態化 (SNP) も dsDNA の安定性をわずかに変化させ,識別可能な特異なプロファイルを作成する.このプロセスは3つのステップで構成される:

  1. PCR増幅: 飽和した?? 光染料 (EvaGreenやLCGreenのような3代目の染料など) を反応混合物に加える.これらの染料は,DSDNAに結合すると強い発光を放出し,結合していない状態では低発光を示します.

  2. 漸進的な熱分離: PCR の後,装置は非常に細い熱解像度で低温から高温に温度を上昇させます. dsDNA が単一鎖に溶け,染料が分離すると,発光強度が低下し,溶融曲線を形成する (図1).

  3. データ分析: 試料間の配列変化は,溶融温度と曲線形状の違いによって決定されます.TmDNAの50%が二鎖で,50%が単鎖の温度で定義されます.これはアンプリカンの長さ,GC含有量,基本的補完性 単一の基礎の変化はTm.

High-Resolution Melting Analysis: Decoding Genotypes from Thermal Dissociation Curves

JLM-Lifetech HRM プラットフォームによって生成された原材料の融解曲線.温度が上昇し,飽和染料がDNAデュプレックスから放出されるにつれて,相対的熒光単位 (RFU) の徐々に減少する低温では,DNAは多量の染料結合で二重鎖で留まり,高い熒光性を生み出します.Tm高温では,DNAは完全に単鎖になり,発光量が基値に低下します.微小な変化を示していますTm紫:GG 黄色:AA 赤:ヘテロジゴート (ヘット)

HRM分析は,標準のメルト曲線分析とは3つの主な分野で異なります.

  • 化学システム:HRMは,エヴァグリーン,LCGreen,SYTO9などの濃度が高い飽和性濃度と明るい熒光性のある染料を使用します.

  • 計測装置:HRMには,0.02°Cから0.1°Cの熱解像度を持つ微細なデータ収集能力を備えた熱循環器が必要である.

  • ソフトウェア:HRMは,高度な熒光アルゴリズムと特殊なプロット能力を備えた高度なソフトウェアに依存しています.

HRM分析では,ソフトウェアは,原始のフラウレセンスの信号を,相対値1.0と0に自動的に正規化します (図2).ベースラインの背景変動をなくし,微小な曲線差に対する感受性を高める配列変異は温度変化や曲線の形状の変化によって識別される.ホモジゴットアレルは,通常,x軸に沿った水平温度変化 (紫と黄色の曲線) として現れる.ヘテロジゴットは,ワイルド型と変異型鎖の間に形成された不一致を含むヘテロドゥプレクスの低温安定性によって引き起こされる曲線形 (赤色の曲線) の変化によって特徴付けられる.微妙な変化を視覚化しやすくするためにHRMデータは,選択された参照値に対する変動を拡大する差のグラフとして表示される (図3).

High-Resolution Melting Analysis: Decoding Genotypes from Thermal Dissociation Curves

JLM-Lifetech HRM プラットフォームから標準化された溶融曲線.サンプル間の初期熒光強度変動を排除するために,ソフトウェアは,溶融前発光度を1に設定して,生データを正規化します.曲線の形状と形状を均等にスケールし,Tmホモジゴット (野生型/変異型) は温度軸に沿って水平シフトを示しますTm右にシフトし,より低くTm交差点は左に移動する.異種子は安定性を低下させ,シフトと形状変形 ("肩"を生成する) を引き起こす異種子の不一致を形成する.紫:GG;黄色:AA;赤:異種子は (het).

High-Resolution Melting Analysis: Decoding Genotypes from Thermal Dissociation Curves

図3.JLM-Lifetech HRMプラットフォームからの差差曲線.ソフトウェアは1つのサンプルを基値として指定し (通常はワイルド型ホモジゴート) それから他のすべての標準化された曲線を引く.ほぼ平らな差直線は,参照と配列同一性を示します.代替ホモジゴート (例えば,変異したホモジゴート) は,ポジティブまたはネガティブなピークを意味する全体的なシフトを示します.ヘテロジゴットPCR製品には不安定なヘテロドゥプレックスが含まれているため紫:GG;黄色:AA;赤:ヘテロジゴート (het).

3つのグラフ間の関係が以下のように要約できます:原形曲線は全体的な存在を確認し,正規化された曲線は相対シフトの大きさを測定します.差異曲線は特定のゲノタイプ差異を示します.


HRM 実験の成功のための3つの重要な要素

HRMは実験条件に非常に敏感である.以下のパラメータが直接データ品質を決定する.

  • 飽和染料:第三世代の飽和染料 (例えば,EvaGreen,LCGreen) が必要である.SYBR グリーンのような従来の染料は高濃度でPCRを抑制し,低濃度で使用すると溶解中に"染料ジャンプ"または再分配を受けます解決を脅かしています

  • 短いアンプリカン:アンプリカンは理想的には<100 bp長い38・50bp短い断片は,SNPを拡大します.Tm単基の変化によって引き起こされる変化です

  • 装置の安定性:高解像度 qPCR システムと熱の均一性や感度が優れているのは,データ収集密度の高いことを確保するために専用のHRM ソフトウェアと組み合わせて必要不可欠です.