Как измерять невидимые изменения?

В волне точной медицины и раннего скрининга рака метилирование ДНК как самая классическая эпигенетическая модификация становится "золотым стандартом биомаркеров" для диагностики заболеваний.метилированный цитозин (5mC) и неметилированный цитозин (C) полностью идентичны с точки зрения первичной базовой последовательностиКак квантитативная ПЦР в режиме реального времени (qPCR) преодолевает этот разрыв для достижения точной количественной оценки метилирования генов?В этой статье рассматривается основная техническая логика qPCR при обнаружении метилирования.

qPCR сама по себе не может напрямую распознавать модификации метилирования; ключ к преодолению этого ограничения лежит на этапе предварительной обработкиПреобразование бисульфита.

При специальной химической обработке неметилированные цитозины (C) в образце ДНК подвергаются деаминационной реакции, преобразуя их в урацил (U),который распознается полимеразой при последующей амплификации ПЦР и сочетается с тимином (T)Напротив, 5mC, защищенный своей метиловой группой, остается совершенно неизменным в виде C.

Этот шаг умно преобразует изначально невидимую эпигенетическую модификацию в видимую разницу в последовательности оснований (изменение от С к Т),о создании основы для особого признания qPCR.

После завершения преобразования последовательности система qPCR захватывает сигналы метилирования с помощью тщательно разработанных праймеров и зондов.

• MS-qPCR / qMSP (количественная метилирующая специфическая ПЦР):Для конвертированных последовательностей два набора праймеров разрабатываются отдельно: один набор идеально соответствует метилированной последовательности (М-праймеры), в то время как другой соответствует неметилированной последовательности (U-праймеры).qPCR селективно усиливает и количественно определяет метилированные последовательности.

  

• Метилайт:Основываясь на MS-qPCR, MethyLight включает в себя зонды TaqMan (двойные маркированные зонды, несущие фторфор и тушитель).Экзонуклеаза Taq DNA полимеразы гидролизирует зонд.Сравнивая значения Cq по каналам, можно вычислить точный процент метилирования целевых участков.легко различать статус отдельных объектов CpG.

  

Во время реакции qPCR прибор контролирует накопление флуоресцентного сигнала в режиме реального времени.

В анализе данных обычно используется относительная количественная оценка: в качестве исходного показателя используется ген домашнего хозяйства или референтный ген, а процент метилирования рассчитывается по формуле:

В качестве альтернативы стандартные кривые, нарисованные с использованием метилированных стандартов известных концентраций, могут дать абсолютное соотношение метилирования.

С помощью этой строгой логики qPCR может обнаруживать следы аномальных сигналов метилирования в пробе от 1% до 5%.

• Высокая чувствительность:Может обнаруживать метилированные аллели в пределах 1% - 5%.

• Точная количественная оценка:Идеально подходит для клинических образцов с низким вводом клеточной ДНК (ctDNA).

• Экономически эффективный:Более низкая стоимость по сравнению с NGS или цифровой ПЦР (dPCR), что делает его идеальным для проверки некоторых ключевых сайтов CpG.

• Зависит от конверсии:В значительной степени зависит от эффективности преобразования бисульфитов.

• Комплексный дизайн накладки:Высокое содержание GC или плотные области CpG затрудняют разработку праймера.

• Целевая область применения:Подходит только для целенаправленного анализа нескольких участков; не идеально подходит для скрининга всего генома.

• Рекомендации по контролю:Всегда проводить положительный контроль (полностью метилированная ДНК), отрицательный контроль (полностью неметилированная ДНК) и контроль без шаблона (NTC) с каждой партией.