High-Resolution Melting Analysis: Dekodierung von Genotypen aus Thermal Dissociation Kurven

Die High-Resolution Melting (HRM) -Analyse bewertet die grafischen Merkmale von DNA-Schmelzkürben nach PCR-Produkten, um Sequenzvariationen in Nukleinsäuren zu identifizieren.Durch das Erkennen von kleinen Abfolgeunterschieden, ermöglicht es die Unterscheidung zwischen Nukleinsäurearten für Anwendungen wie Mutationsscan, Genotypisierung und Methylierungsanalyse.Die analysierten Amplikonen können anschließend einer nachgelagerten Charakterisierung durch Gelelektrophore oder Sequenzierung unterzogen werden.HRM erfordert jedoch ein quantitatives PCR-System in Echtzeit mit überlegener thermischer Stabilität und Empfindlichkeit sowie eine spezielle HRM-Analysesoftware.

Mechanismus der HRM: Von der Sättigungsfärbung bis zur Signallauflösung

Das Kernprinzip besteht darin, Fluoreszenzveränderungen in Echtzeit zu überwachen, wenn sich doppelsträngige DNA (dsDNA) bei Temperaturerhöhung in einsträngige DNA (ssDNA) schmilzt.Erzeugung einer einzigartigen SchmelzkürbeSelbst ein einzelner Nukleotid-Polymorphismus (SNP) verändert die Stabilität der dsDNA geringfügig und erzeugt ein ausgeprägtes, identifizierbares Profil. Der Prozess besteht aus drei Schritten:

1. PCR-Verstärkung: Der Reaktionsmischung werden gesättigte fluoreszierende Farbstoffe (wie Farbstoffe der dritten Generation wie EvaGreen oder LCGreen) hinzugefügt.Diese Farbstoffe emittieren eine starke Fluoreszenz, wenn sie an dsDNA gebunden sind, und zeigen eine geringe Fluoreszenz in ihrem ungebundenen Zustand..

2. Graduelle thermische Dissoziation: Nach der PCR erhöht das Instrument die Temperatur von niedrig auf hoch bei extrem feiner thermischer Auflösung.die Fluoreszenzintensität verringert und eine Schmelzkürbe bildet (Abbildung 1).

3. Datenanalyse: Die Abfolgeänderungen zwischen den Proben werden durch Unterschiede in der Schmelztemperatur und der Kurvenform bestimmt.Tmist definiert als die Temperatur, bei der 50% der DNA doppeltsträngig und 50% einsträngig sind.und BasiskomplementaritätTm.

Abbildung 1. Die von der JLM-Lifetech-HRM-Plattform erzeugte Rohschmelzkürbe.Es zeigt den allmählichen Rückgang der relativen Fluoreszenseinheiten (RFU), wenn die Temperatur steigt und gesättigte Farbstoffe aus dem DNA-Duplex freigesetzt werdenBei niedrigeren Temperaturen bleibt die DNA doppelsträngig mit reichlich Farbstoffbindung und erzeugt eine hohe Fluoreszenz.TmBei hohen Temperaturen wird die DNA vollständig einsträngig, wodurch die Fluoreszenz auf Basiswerte sinkt.Unterschiedliche DNA-Sequenzen zeigen kleine Abweichungen inTmViolett: GG; Gelb: AA; Rot: Heterozygot (het).

Die HRM-Analyse unterscheidet sich von der Standard-Schmelzkürbenanalyse in drei Hauptbereichen:

• Chemie-System: HRM verwendet Farbstoffe mit höheren Sättigungskonzentrationen und hellerer Fluoreszenz, wie EvaGreen, LCGreen und SYTO9.

• Instrumente: HRM erfordert Wärmezyklereinheiten, die eine feine Datenerfassung mit einer thermischen Auflösung von 0,02 ∼ 0,1 °C ermöglichen.

• Software: HRM setzt auf fortschrittliche Software mit ausgeklügelten fluoreszierenden Algorithmen und spezialisierten Plotting-Fähigkeiten.

Bei der HRM-Analyse normalisiert die Software automatisch Rohfluoreszenzsignale auf relative Werte von 1,0 und 0 (Abbildung 2).Beseitigung von Hintergrundschwankungen der Ausgangswerte und Verbesserung der Empfindlichkeit gegenüber geringfügigen KurvenunterschiedenDie Sequenzvariationen werden entweder durch Temperaturverschiebungen oder durch Veränderungen der Kurvenform ermittelt.Homozygote Allele treten typischerweise als horizontale Temperaturverschiebungen entlang der X-Achse auf (violette und gelbe Kurven). Heterozygoten zeichnen sich durch Veränderungen in der Kurvenform (rote Kurve) aus, die durch die geringere thermische Stabilität von heteroduplexen mit Fehlanpassungen zwischen Wild- und Variantensträngen verursacht werden.Um subtile Variationen leichter zu visualisieren, werden die HRM-Daten häufig als Differenzdiagramme dargestellt, die die Variationen in Bezug auf eine ausgewählte Referenz verstärken (Abbildung 3).

Abbildung 2. Normierte Schmelzkürbe aus der JLM-Lifetech-HRM-Plattform.Die Software normalisiert die Rohdaten, indem sie die Fluoreszenz vor dem Schmelzen auf 1 setzt..0 und Fluoreszenz nach dem Schmelzen auf 0. Dies skaliert alle Kurven gleichmäßig, so dass Kurvenform undTmBei Homozygoten (wilder Typ/mutant) treten horizontale Verschiebungen entlang der Temperaturachse auf.TmSchiebungen nach rechts, während niedrigerTmHeterozygoten bilden uneinheitliche Heteroduplexen, die die Stabilität reduzieren und sowohl eine Verschiebung als auch eine Formdeformation verursachen (was eine "Schulter" erzeugt)..

Abbildung 3. Unterschiedskurve aus der JLM-Lifetech-HRM-Plattform. Die Software benennt eine Probe als Basislinie (typischerweise die Wild-Typ-Homozygote) und subtrahiert alle anderen normalisierten Kurven davon.Eine nahezu flache Differenzlinie zeigt die Sequenzidentität mit der Referenz anEine alternative Homozygote (z.B. eine mutante Homozygote) zeigt eine Gesamtschaltung, die zu einem positiven oder negativen Peak führt.Da heterozygote PCR-Produkte instabile Heteroduplexen enthalten, verändern sich ihre Kurvenformen signifikant und erzeugen eindeutige "W-" oder "M"-förmige charakteristische Spitzen für eine einfache Identifizierung.

Die Beziehung zwischen den drei Grafiken kann so zusammengefasst werden: Rohkurven überprüfen die Gesamtpräsenz; normalisierte Kurven messen die relative Verschiebungsgröße;Unterschiedskurven zeigen spezifische Genotypdivergenzen.

Drei entscheidende Faktoren für erfolgreiche HRM-Experimente

Die Datenqualität wird direkt durch folgende Parameter bestimmt:

• Sättigungsfarbstoffe: Sättigungsfarbstoffe der dritten Generation (z. B. EvaGreen, LCGreen) sind erforderlich.Herkömmliche Farbstoffe wie SYBR Green hemmen die PCR bei hohen Konzentrationen und werden bei niedrigen Konzentrationen beim Schmelzen "Dye Jumping" oder umverteilt, was die Auflösung erheblich beeinträchtigt.

• Kurze Amplikaner: Amplikaner sollten idealerweise< 100 Basispunktelang mit38 ¢50 bpEs wird empfohlen, die Daten zu den bekannten SNP-Standorten zu sammeln.TmVerschiebung durch Veränderungen einer einzigen Basis.

• Instrumentstabilität: QPCR-Systeme mit hoher Auflösung mit ausgezeichneter thermischer Einheitlichkeit und Empfindlichkeit sind unerlässlich, kombiniert mit einer speziellen HRM-Software, um eine hohe Datenerfassungsdichte sicherzustellen.