High-Resolution Melting Analysis: Decoderen van genotypen uit thermische dissociatiecurven

Bij de analyse van High-Resolution Melting (HRM) worden de grafische kenmerken van post-PCR-product DNA-smeltcurves geëvalueerd om sequentievariaties in nucleïnezuren te identificeren.Door het detecteren van kleine sequentieverschillen, maakt het mogelijk om onderscheid te maken tussen nucleïnezuursoorten voor toepassingen zoals mutatiescanning, genotyping en methylatieanalyse.de geanalyseerde ampliconen kunnen vervolgens worden gekenmerkt met behulp van gelelektrophoresis of sequentieHRM vraagt echter om een real-time kwantitatief PCR-systeem met superieure thermische stabiliteit en gevoeligheid, samen met een speciale HRM-analyse-software.

Mechanisme van HRM: van verzadiging tot signaalresolutie

Het kernprincipe is dat fluorescentieveranderingen in realtime worden gecontroleerd wanneer dubbelstrengig DNA (dsDNA) bij temperatuurstijging in enkelstrengig DNA (ssDNA) smelt.het genereren van een unieke smeltcurveZelfs een enkel nucleotide-polymorfisme (SNP) verandert de stabiliteit van dsDNA enigszins, waardoor een duidelijk, identificeerbaar profiel ontstaat.

1. PCR-amplificatie: verzadigde fluorescerende kleurstoffen (zoals kleurstoffen van de derde generatie zoals EvaGreen of LCGreen) worden aan het reactiemengsel toegevoegd.Deze kleurstoffen geven een sterke fluorescentie af wanneer ze aan dsDNA gebonden zijn en vertonen een lage fluorescentie in hun niet-gebonden toestand.

2. Graduele thermische dissociatie: na PCR verhoogt het instrument de temperatuur van laag naar hoog met een zeer fijne thermische resolutie.waardoor de intensiteit van de fluorescentie afneemt en een smeltcurve ontstaat (figuur 1).

3. Gegevensanalyse: de variaties in de volgorde tussen de monsters worden bepaald door verschillen in smelttemperatuur en curvevorm.Tmwordt gedefinieerd als de temperatuur waarbij 50% van het DNA dubbelstrengig en 50% enkelstrengig is.en basiscomplementariteit. Elke enkele basiswijziging veroorzaakt een subtiele verschuiving inTm.

Figuur 1. Grafiek van de smeltkracht van ruwe grond die is gegenereerd door het JLM-Lifetech HRM-platform.Het illustreert de geleidelijke daling van de relatieve fluorescentie-eenheden (RFU) naarmate de temperatuur stijgt en verzadigde kleurstoffen uit de DNA-duplex worden vrijgegevenBij lagere temperaturen blijft DNA dubbelstreng met een overvloedige binding van kleurstoffen, waardoor een hoge fluorescentie ontstaat.TmBij hoge temperaturen wordt het DNA volledig eenstreng, waardoor de fluorescentie terugvalt naar basisniveaus.Verschillende DNA-sequenties vertonen kleine variaties inTmPaars: GG; geel: AA; rood: heterozygoot (het).

De HRM-analyse verschilt in drie belangrijke opzichten van de standaard smeltcurve-analyse:

• Chemie systeem: HRM gebruikt kleurstoffen met hogere verzadigingsconcentraties en helderder fluorescentie, zoals EvaGreen, LCGreen en SYTO9.

• Instrumenten: HRM vereist thermische cyclers die in staat zijn om fijne gegevens te verzamelen met een thermische resolutie van 0,02 ∼ 0,1 °C.

• Software: HRM is afhankelijk van geavanceerde software met geavanceerde fluorescerende algoritmen en gespecialiseerde plottingsmogelijkheden.

Bij HRM-analyse normaliseert de software automatisch ruwe fluorescentiesignalen naar relatieve waarden van 1,0 en 0 (figuur 2),het elimineren van baseline achtergrondvariaties en het verbeteren van de gevoeligheid voor kleine verschillen in de curveSequentieverschillen worden geïdentificeerd door temperatuurverschuivingen of veranderingen in de vorm van de curve.Homozygote allelen verschijnen meestal als horizontale temperatuurverschuivingen langs de x-as (paarse en gele krommen)Heterozygoten worden gekenmerkt door veranderingen in de vorm van de curve (rode curve), veroorzaakt door de lagere thermische stabiliteit van heteroduplexen die mismatch bevatten, gevormd tussen wildtype en variantstrengen.Om subtiele variaties makkelijker te visualiseren, HRM-gegevens worden vaak weergegeven als verschillengrafieken die variaties ten opzichte van een geselecteerde referentie versterken (figuur 3).

Figuur 2. Genormaliseerde smeltcurve van het JLM-Lifetech HRM-platform.De software normaliseert de ruwe gegevens door de fluorescentie voor het smelten in te stellen op 1.0 en fluorescentie na het smelten tot 0. Dit schaalt alle krommen gelijkmatig, waardoor de vorm van de curve enTmHet is duidelijk dat de verschillen tussen de verschillende soorten homozygoten rechtstreeks vergelijkbaar zijn.Homozygoten (wilde type/mutant) vertonen horizontale verschuivingen langs de temperatuurasTmverschuift naar rechts, terwijl lagerTmHeterozygoten vormen mismatched heteroduplexes die de stabiliteit verminderen, waardoor zowel een verschuiving als een vormvervorming (het produceren van een "schouder"). Paars: GG; Geel: AA; Rood: Heterozygoot (het).

Figuur 3. Verschilcurve van het JLM-Lifetech HRM-platform. De software wijst één monster als basislijn aan (typisch de homozygoot van het wilde type) en subtraheert alle andere genormaliseerde curves daaruit.Een bijna vlakke verschillijn geeft sequentie-identiteit aan met de referentieEen alternatieve homozygoot (bijv. een gemuteerde homozygoot) vertoont een algemene verschuiving die resulteert in een positieve of negatieve piek.Omdat heterozygote PCR-producten onstabiele heteroduplexen bevatten, hun curve vormen veranderen aanzienlijk, het genereren van duidelijke "W-" of "M-" gevormde karakteristieke pieken voor een eenvoudige identificatie.

De relatie tussen de drie grafieken kan als volgt worden samengevat: ruwe curves controleren de totale aanwezigheid; genormaliseerde curves meten de relatieve verschuivingsgrootte;verschillen curves onthullen specifieke genotype divergentie.

Drie essentiële factoren voor succesvolle HRM-experimenten

De volgende parameters bepalen rechtstreeks de kwaliteit van de gegevens:

• Verzadigende kleurstoffen: verzadigde kleurstoffen van de derde generatie (bijv. EvaGreen, LCGreen) zijn vereist.Conventionele kleurstoffen zoals SYBR Green remmen PCR bij hoge concentraties en ondergaan tijdens het smelten "dye jumping" of herverdeling wanneer ze bij lage concentraties worden gebruikt, waardoor de resolutie ernstig wordt aangetast.

• Korte amplicons: Amplicons moeten idealiter< 100 bplang, met38 ‰ 50 basispuntenIn de meeste gevallen is het gebruik van de SNP-systeem niet aanbevolen.Tmverschuiving veroorzaakt door veranderingen van één basis.

• Instrumentstabiliteit: QPCR-systemen met een hoge resolutie met uitstekende thermische uniformiteit en gevoeligheid zijn essentieel, in combinatie met speciale HRM-software om een hoge gegevensopname dichtheid te garanderen.