Analyse de fusion à haute résolution : décoder les génotypes à partir des courbes de dissociation thermique

L'analyse par fusion à haute résolution (HRM) évalue les caractéristiques graphiques des courbes de fusion de l'ADN des produits post-PCR afin d'identifier les variations de séquence dans les acides nucléiques.En détectant des différences de séquence minimes, il permet de faire la distinction entre les espèces d'acides nucléiques pour des applications telles que le balayage des mutations, le génotypage et l'analyse de la méthylation.les amplicones analysés peuvent ensuite être soumis à une caractérisation en aval par électrophorèse par gel ou séquençageCependant, la gestion des ressources humaines exige un système de PCR quantitatif en temps réel avec une stabilité thermique et une sensibilité supérieures, ainsi qu'un logiciel d'analyse dédié à la gestion des ressources humaines.

Mécanisme de gestion des ressources humaines: de la coloration par saturation à la résolution du signal

Le principe de base consiste à surveiller les changements de fluorescence en temps réel lorsque l'ADN à double brin (dsDNA) fond en ADN à brin unique (ssDNA) lors de l'élévation de la température,générant une courbe de fusion uniqueMême un seul polymorphisme nucléotidique (SNP) modifie légèrement la stabilité de l'ADN, créant un profil distinct et identifiable.

1. Amplification PCR: des colorants fluorescents saturés (tels que les colorants de troisième génération comme EvaGreen ou LCGreen) sont ajoutés au mélange de réaction.Ces colorants émettent une forte fluorescence lorsqu'ils sont liés à l'ADN et présentent une faible fluorescence dans leur état non lié.

2. Dissociation thermique progressive: après PCR, l'instrument augmente la température de bas à haut à une résolution thermique extrêmement fine.provoquant une diminution de l'intensité de la fluorescence et formant une courbe de fusion (figure 1).

3. Analyse des données: les variations de séquence entre les échantillons sont déterminées par les différences de température de fusion et de forme de la courbe.Tmest définie comme la température à laquelle 50% de l'ADN est double-filé et 50% est à un seul fil. Elle dépend de la longueur de l'amplicon, de la teneur en GC,et la complémentarité de la base, toute modification d'une seule base induit unTm.

Figure 1. courbe de fusion brute générée par la plateforme JLM-Lifetech HRM.Il illustre la baisse progressive des unités de fluorescence relatives (UFR) à mesure que la température augmente et que des colorants saturés sont libérés du duplex d'ADNÀ des températures plus basses, l'ADN reste double-filé avec une liaison abondante de colorant, produisant une fluorescence élevée.TmÀ des températures élevées, l'ADN devient complètement à un seul brin, la fluorescence tombant aux niveaux de base.Des séquences d'ADN distinctes présentent de légères variationsTmPourpre: GG; Jaune: AA; Rouge: Hétérozygote (héte).

L'analyse de la MDP diffère de l'analyse standard de la courbe de fusion dans trois domaines principaux:

• Système chimique: la MHR utilise des colorants à concentration de saturation plus élevée et à fluorescence plus lumineuse, tels qu'EvaGreen, LCGreen et SYTO9.

• Instrumentation: la gestion des ressources humaines nécessite des cyclistes thermiques capables d'acquérir des données fines avec une résolution thermique de 0,02 ∼ 0,1 °C.

• Logiciel: la gestion des ressources humaines repose sur un logiciel avancé doté d'algorithmes fluorescents sophistiqués et de capacités de traçage spécialisées.

Dans l'analyse HRM, le logiciel normalise automatiquement les signaux de fluorescence brutes à des valeurs relatives de 1,0 et 0 (figure 2),éliminer les variations de fond de référence et améliorer la sensibilité aux différences mineures de courbeLes variations de séquence sont identifiées soit par des changements de température, soit par des changements de forme de courbe.Les allèles homozygotes apparaissent généralement sous forme de changements de température horizontaux le long de l'axe des x (courbes violettes et jaunes)Les hétérozygotes se caractérisent par des altérations de la forme de la courbe (courbe rouge), causées par la moindre stabilité thermique des hétéroduplexes contenant des déséquilibres formés entre les brins de type sauvage et les brins variants.Pour faciliter la visualisation des variations subtiles, les données de gestion des ressources humaines sont souvent affichées sous forme de graphiques de différence qui amplifient les variations par rapport à une référence sélectionnée (figure 3).

Figure 2. courbe de fusion normalisée de la plateforme JLM-Lifetech HRM. Pour éliminer les variations d'intensité de fluorescence initiale entre les échantillons,Le logiciel normalise les données brutes en réglant la fluorescence de pré-fusage à 1.0 et la fluorescence post-fusée à 0. Cela équivaut à toutes les courbes uniformément, ce qui rend la forme de la courbe etTmLes différences sont directement comparables.Les homozygotes (de type sauvage/mutant) présentent des changements horizontaux le long de l'axe de températureTmse déplace vers la droite, tandis que plus basTmLes hétérozygotes forment des hétéroduplexes déséquilibrés qui réduisent la stabilité, provoquant à la fois un déplacement et une déformation de la forme (produisant une "épaule")..

Figure 3. courbe de différence de la plateforme JLM-Lifetech HRM. Le logiciel désigne un échantillon comme référence (généralement l'homozygote de type sauvage) et en soustrait toutes les autres courbes normalisées.Une ligne de différence presque plate indique l'identité de la séquence avec la référenceUn homozygote alternatif (par exemple, un homozygote mutant) montre un changement global entraînant un pic positif ou négatif.Parce que les produits de PCR hétérozygotes contiennent des hétéroduplexes instablesLe violet: GG; le jaune: AA; le rouge: hétérozygote (het).

La relation entre les trois graphiques peut être résumée comme suit: les courbes brutes vérifient la présence globale; les courbes normalisées mesurent l'amplitude relative du déplacement;les courbes de différence révèlent une divergence spécifique du génotype.

Trois facteurs essentiels pour réussir les expériences de gestion des ressources humaines

La gestion des ressources humaines est très sensible aux conditions expérimentales.

• Colorants saturants: des colorants saturés de troisième génération (par exemple, EvaGreen, LCGreen) sont requis.Les colorants conventionnels comme le SYBR Green inhibent la PCR à des concentrations élevées et subissent un "saut de colorant" ou une redistribution pendant la fusion lorsqu'ils sont utilisés à de faibles concentrations, compromettant gravement la résolution.

• Amplificateurs courts: les amplificateurs devraient idéalement être< 100 p.p.longue, avec38 ¢ 50 pbLes fragments plus courts amplifient laTmdécalage induit par des altérations de base unique.

• Stabilité de l'instrument: des systèmes qPCR haute résolution avec une excellente uniformité thermique et une excellente sensibilité sont essentiels, associés à un logiciel dédié à la gestion des ressources humaines pour assurer une forte densité d'acquisition de données.