고해상도 용융 분석: 열 해리 곡선에서 유전형 해독

고해상도 녹화 (High-Resolution Melting, HRM) 분석은 핵산의 염기서열 변화를 식별하기 위해 PCR 후 제품 DNA 녹화 곡선의 그래픽 특징을 평가합니다.분자 순서 차이를 감지함으로써, 그것은 돌연변이 스캔, 유전자 형식, 메틸화 분석과 같은 응용 프로그램에서 핵산 종 간의 차별을 가능하게합니다.분석된 앰플리콘은 젤 전극분석 또는 염기서열 분석을 사용하여 하류 특성화 될 수 있습니다.그러나 HRM는 뛰어난 열 안정성과 민감성을 가진 실시간 양적 PCR 시스템을 요구하며 전용 HRM 분석 소프트웨어와 함께합니다.

인력 관리 메커니즘: 포화 염색에서 신호 해상도

핵심 원리는 두 줄무늬 DNA (dsDNA) 가 온도 상승 과정에서 단일 줄무늬 DNA (ssDNA) 로 녹는 동안 실시간으로 형광 변화를 모니터링하는 것입니다.독특한 녹기 곡선을 생성합니다.. 단일 핵유질 다형성 (SNP) 도 dsDNA의 안정성을 약간 변경하여 구별되고 식별 가능한 프로필을 생성합니다. 프로세스는 세 단계로 구성됩니다:

1. PCR 증폭: 포화 된 형광 염료 (EvaGreen 또는 LCGreen과 같은 세 번째 세대 염료) 가 반응 혼합물에 첨가됩니다.이 염료들은 dsDNA에 결합했을 때 강한 형광을 방출하고 결합되지 않은 상태에서는 낮은 형광을 나타냅니다..

2. 점진적 열분열: PCR를 거쳐 기기는 극히 미세한 열분열에서 낮은 온도에서 높은 온도로 온도를 높인다. dsDNA가 단일 나선으로 녹아들면서 염료는 분열된다.형광 강도가 감소하여 녹기 곡선을 형성합니다. (그림 1).

3. 데이터 분석: 샘플 간의 염기서열 변화는 녹는 온도와 곡선 모양의 차이로 결정됩니다.TmDNA의 50%가 이중계열이 되고 50%가 단일계열이 되는 온도로 정의됩니다.그리고 염기 상호 보완성Tm.

그림 1. JLM-Lifetech HRM 플랫폼에 의해 생성된 원료 녹기 곡선.온도가 높아지고 DNA 듀플렉스에서 포화 염료가 방출됨에 따라 상대적 형광 단위 (RFU) 의 점진적인 감소를 보여줍니다.더 낮은 온도에서 DNA는 두 줄무늬로 남아 있으며 풍부한 염색체 결합으로 높은 형광을 발생시킵니다.Tm, 듀플렉스는 빠르게 분리되어 형광량이 급격히 감소합니다. 높은 온도에서는 DNA가 완전히 단일 나선으로 변하여 형광량이 기본 수준으로 떨어집니다.특정 DNA 염기서열은Tm그리고 곡선 형태. 보라색: GG; 노란색: AA; 빨간색: 헤테로시고트 (het).

HRM 분석은 표준 녹기 곡선 분석과 크게 세 가지 측면에서 다릅니다.

• 화학 시스템: HRM는 EvaGreen, LCGreen 및 SYTO9와 같은 더 높은 포화 농도와 밝은 형광을 가진 염료를 사용합니다.

• 기기: HRM는 0.02~0.1°C의 열 해상도를 가진 미세한 데이터 획득을 할 수있는 열 사이클러를 필요로합니다.

• 소프트웨어: HRM는 정교한 형광 알고리즘과 특화된 플롯링 기능을 갖춘 고급 소프트웨어에 의존합니다.

HRM 분석에서 소프트웨어는 원시 형광 신호를 1.0 및 0의 상대적 값으로 자동으로 정상화합니다.기본 배경 변동을 제거하고 경미한 곡선 차이에 대한 감수성을 높입니다.순서 변동은 온도 변화 또는 곡선 모양 변화로 확인됩니다.호모질성 알레일은 일반적으로 x축을 따라 수평 온도 변화로 나타납니다 (포랑색과 노란색 곡선)헤테로시고트는 야생형과 변종 스트랜트 사이에 형성된 불일치 함유의 헤테로두플렉스의 열 안정성이 낮기 때문에 곡선 모양 (붉은 곡선) 의 변화가 특징입니다.미묘한 변형을 쉽게 시각화하기 위해, HRM 데이터는 종종 선택된 참조에 대한 변동을 증폭시키는 차이 그래프로 표시됩니다 (그림 3).

그림 2. JLM-Lifetech HRM 플랫폼에서 정상화 된 녹기 곡선. 샘플 간의 초기 형광 강도 변동을 제거하기 위해,소프트웨어는 1으로 미연 형광을 설정하여 원료 데이터를 정상화합니다.0.0과 0으로 녹음 후 형광이 모든 곡선을 균일하게 스케일, 곡선 모양과Tm직접 비교할 수 있는 차이점. 호모질질체 (야생형/변종형) 는 온도 축을 따라 수평적 이동을 나타냅니다.Tm오른쪽으로 이동, 낮은 동안Tm좌우로 이동한다. 헤테로질고트는 안정성을 감소시키는 부합되지 않은 헤테로두플렉스를 형성하여 이동과 모양 변형 (" 어깨"를 생성) 을 일으킨다. 보라색: GG; 노란색: AA; 빨간색: 헤테로질고트 (het).

그림 3. JLM-Lifetech HRM 플랫폼의 차이 곡선. 소프트웨어는 하나의 샘플을 기준선으로 지정하고 (일반적으로 야생형 호모지고트) 그로부터 다른 모든 정상화 곡선을 깎아냅니다.거의 평평한 차이 선은 참조와 연속 동일성을 나타냅니다.대안의 호모질동체 (예를 들어, 돌연변이 호모질동체) 는 긍정적 또는 부정적인 정점을 초래하는 전반적인 전환을 나타냅니다.헤테로시고트 PCR 제품에는 불안정한 헤테로두플렉스가 포함되어 있기 때문에, 곡선 모양이 크게 변화하여 명확한 "W-" 또는 "M-" 모양의 특징적 정상을 생성하여 직접적으로 식별 할 수 있습니다. 보라색: GG; 노란색: AA; 빨간색: 이성질체 (het).

세 개의 그래프 사이의 관계는 다음과 같이 요약 될 수 있습니다. 원시 곡선은 전체 존재를 검사합니다. 정상화 된 곡선은 상대적 이동 크기를 측정합니다.차이 곡선은 특정 유전형의 차이를 나타냅니다..

성공적인 HRM 실험을 위한 세 가지 중요한 요소

HRM는 실험 조건에 매우 민감합니다. 다음 매개 변수는 데이터 품질을 직접 결정합니다.

• 포화 염료: 세 번째 세대의 포화 염료 (예를 들어, EvaGreen, LCGreen) 가 필요합니다.SYBR 그린과 같은 전통적인 염료는 높은 농도에서 PCR를 억제하고 낮은 농도에서 사용되면 녹는 동안 " 염료 점프 " 또는 재배포를 겪습니다., 심각하게 해제 해상도.

• 짧은 앰플리콘: 앰플리콘은 이상적으로<100 bp길고,38~50 bp알려진 SNP 사이트 주변에서 권장됩니다. 짧은 조각은Tm단일 기지 변화로 인한 변화

• 기기 안정성: 고해상도 qPCR 시스템과 뛰어난 열 일률성과 민감성이 필수적이며, 높은 데이터 획득 밀도를 보장하기 위해 전용 HRM 소프트웨어와 결합됩니다.