Comment mesurer les modifications invisibles?

Dans la vague de la médecine de précision et du dépistage précoce du cancer, la méthylation de l'ADN, la modification épigénétique la plus classique, devient un "biomarqueur de référence" pour le diagnostic de la maladie.La cytosine méthylée (5mC) et la cytosine non méthylée (C) sont complètement identiques en termes de séquence de base primaireComment la PCR quantitative en temps réel (qPCR) traverse-t-elle cette fracture pour obtenir une quantification précise de la méthylation des gènes?Cet article décompose la logique technique de base derrière la QPCR dans la détection de la méthylation.

Le qPCR lui-même ne peut pas reconnaître directement les modifications de méthylation; la clé pour dépasser cette limitation réside dans l'étape de prétraitementConversion des bisulfites.

Lors d'un traitement chimique spécifique, les cytosines non méthylées (C) de l'échantillon d'ADN subissent une réaction de déamination, qui les convertit en uracile (U),qui est reconnu par la polymérase lors d'une amplification PCR ultérieure et jumelé en thymine (T)En revanche, le 5mC, protégé par son groupe méthyle, reste totalement inchangé sous forme de C.

Cette étape transforme intelligemment ce qui était à l'origine une modification épigénétique invisible en une différence de séquence de base visible (un changement de C à T),établissant les bases de la reconnaissance spécifique de qPCR.

Une fois la conversion de séquence terminée, le système qPCR capture les signaux de méthylation à l'aide de primers et de sondes méticuleusement conçus.

• MS-qPCR / qMSP (PCR spécifique à la méthylation quantitative):Pour les séquences converties, deux ensembles de primers sont conçus séparément: un ensemble correspond parfaitement à la séquence méthylée (primes M), tandis que l'autre correspond à la séquence non méthylée (primes U).qPCR amplifie et quantifie sélectivement les séquences méthylées.

  

• MethyLight:S'appuyant sur MS-qPCR, MethyLight intègre des sondes TaqMan (sondes à double étiquetage comportant un fluorophore et un extincteur).l'activité de l'exonucléase de la Taq DNA polymérase hydrolyse la sondeEn comparant les valeurs de Cq entre les canaux, le pourcentage de méthylation précis des sites cibles peut être calculé.distingue facilement le statut des sites individuels de CpG.

  

Pendant la réaction qPCR, l'instrument surveille en temps réel l'accumulation du signal fluorescent. Le seuil de cycle auquel la fluorescence franchit un seuil défini est défini comme la valeur Cq.

Dans l'analyse des données, une quantification relative est généralement utilisée: un gène de ménage ou de référence sert de référence, et le pourcentage de méthylation est calculé à l'aide de la formule:

Alternativement, des courbes standard dessinées à l'aide de normes méthylées de concentrations connues peuvent donner le rapport de méthylation absolu.

Avec cette logique rigoureuse, le QPCR peut détecter des traces sensibles de signaux de méthylation anormaux aussi bas que 1% à 5% dans un échantillon.

• Sensitivité élevée:Peut détecter des allèles méthylés aussi bas que 1% ∼5%.

• Quantification précise:Idéal pour les échantillons cliniques et l'ADN sans cellules à faible apport (ADNct).

• Résultats économiques:Un coût inférieur par rapport au NGS ou au PCR numérique (dPCR), ce qui le rend idéal pour valider quelques sites clés de CpG.

• Dépendante de la conversion:Elle dépend fortement de l'efficacité de la conversion des bisulfites.

• Conception de la première couche complexe:Une teneur élevée en GC ou des régions denses en CpG rendent la conception du primer difficile.

• Portée ciblée:Convient uniquement pour l'analyse ciblée de quelques sites; pas idéal pour le dépistage du génome.

• Recommandations de contrôle:Faites toujours un contrôle positif (ADN entièrement méthylé), un contrôle négatif (ADN entièrement non méthylé) et un contrôle sans modèle (NTC) avec chaque lot.