보이지 않는 변형 을 어떻게 측정 합니까?

정밀의학과 초기 암 검진의 물결에서 DNA 메틸레이션 (DNA methylation) 은 가장 고전적인 후천적 변형 (epigenetic modification) 으로 질병 진단의 "금 표준 바이오마커"가 되고 있습니다.메틸화 된 사이토신 (5mC) 과 메틸화 되지 않은 사이토신 (C) 은 1차 염기 염기 서열의 측면에서 완전히 동일합니다.어떻게 실시간 양적 PCR (qPCR) 는 유전자 메틸레이션의 정확한 수치화를 달성하기 위해 이 격차를 넘나들 수 있습니까?이 기사에서는 메틸레이션 검출에 qPCR의 핵심 기술 논리를 분해합니다..

qPCR 자체는 메틸레이션 변형을 직접 인식 할 수 없습니다. 이 제한을 극복하는 열쇠는 사전 처리 단계에 있습니다.비솔피트 변환.

특정 화학적 처리 하에 DNA 샘플에 있는 비메틸화 된 사이토신 (C) 은 디아민화 반응을 거쳐 우라실 (U) 로 변환 됩니다.후속 PCR 증폭 과정에서 폴리메라세에 의해 인식되고 티민 (T) 으로 결합됩니다.반면 5mC는 메틸 그룹에 의해 보호되며 C로 완전히 변하지 않습니다.

이 단계는 원래 보이지 않는 후유증 변형이 보이는 염기 염기서열 차이 (C에서 T로 변화) 로 변하는 현명한 방법입니다.qPCR의 특별 인정의 기초를 마련하는 내용.

염기서열 변환이 완료되면 qPCR 시스템은 세밀하게 설계된 프라이머와 프로브를 사용하여 메틸레이션 신호를 캡처합니다. 주류 탐지 전략에는 다음과 같은 것들이 있습니다.

• MS-qPCR / qMSP (량적 메틸레이션 특성 PCR):변환 된 염기서열에 대해 두 개의 프라이머 세트가 별도로 설계됩니다. 한 세트는 메틸화 된 염기서열 (M 프라이머) 과 완벽하게 일치하며 다른 세트는 메틸화되지 않은 염기서열 (U 프라이머) 과 일치합니다.qPCR는 선택적으로 메틸화 염기서열을 증폭하고 정량화합니다..

  

• 메티 라이트:MS-qPCR를 기반으로 메티 라이트는 TaqMan 프로브 (플루오포르와 소화제를 탑재한 듀얼 레이블 프로브) 를 통합합니다.Taq DNA 폴리메라즈의 외핵화 활동이 검사를 수분화합니다., 형광 신호를 방출합니다. 채널에 걸쳐 Cq 값을 비교함으로써 대상 사이트의 정확한 메틸화 비율을 계산 할 수 있습니다. 이 방법은 매우 높은 특수성을 제공합니다.단일 CpG 사이트의 상태를 쉽게 구별.

  

qPCR 반응 동안 기기는 형광 신호 축적을 실시간으로 모니터링합니다. 형광이 설정된 임계값을 통과하는 사이클 임계값은 Cq 값으로 정의됩니다.

데이터 분석에서 상대적 정량화는 일반적으로 사용됩니다. 하우스키핑 또는 레퍼런스 유전자는 기본 기준으로 작용하며 메틸화 비율은 공식을 사용하여 계산됩니다.

대안적으로, 알려진 농도의 메틸화된 표준을 사용하여 그려진 표준 곡선은 절대 메틸화 비율을 얻을 수 있습니다.

이 엄격한 논리로 qPCR는 민감한 표본에서 1%에서 5%까지의 미틸화 신호를 감지할 수 있습니다.

• 높은 감수성:메틸화된 알레를 1%~5%까지 검출할 수 있습니다.

• 정확한 수치:임상 표본과 낮은 입력 세포 없는 DNA (ctDNA) 에 이상적입니다.

• 비용 효율성:NGS 또는 디지털 PCR (dPCR) 에 비해 저렴한 비용으로 몇 개의 주요 CpG 사이트를 검증하는 데 이상적입니다.

• 변환 의존:이산화탄소 변환의 효율성에 크게 의존합니다.

• 복잡한 프라이머 디자인:높은 GC 함유량이나 밀도가 높은 CpG 영역은 프라이머 설계에 도전을 합니다.

• 대상 적용 범위:일부 부위에서의 표적 분석에만 적합합니다. 전체 게놈 검사를 위해 이상적이지 않습니다.

• 통제 권장 사항:항상 긍정적인 통제 (완전히 메틸화된 DNA), 부정적인 통제 (완전히 메틸되지 않은 DNA) 및 템플릿 없는 통제 (NTC) 를 각 팩과 함께 실행합니다.