Hoe meet je onzichtbare veranderingen? Zie hoe qPCR DNA-methylatie ontgrendelt

In de golf van de precisiegeneeskunde en de vroege screening van kanker wordt DNA-methylatie als de meest klassieke epigenetische modificatie een "gouden standaard biomarker" voor de diagnose van ziekten.methyleerde cytosine (5mC) en niet-methyleerde cytosine (C) zijn volledig identiek in termen van primaire basisequentieHoe overschrijdt real-time kwantitatieve PCR (qPCR) deze kloof om een nauwkeurige kwantificatie van genmethylatie te bereiken?Dit artikel beschrijft de kerntechnische logica achter qPCR bij het detecteren van methylering.

qPCR zelf kan methyleringsmodificaties niet rechtstreeks herkennen; de sleutel tot het doorbreken van deze beperking ligt in de voorbehandelingstapBisulfietconversie.

Onder specifieke chemische behandeling ondergaan de niet-gemethyleerde cytosines (C) in het DNA-monster een deaminatie-reactie, waardoor ze worden omgezet in uracil (U),die wordt herkend door de polymerase tijdens de daaropvolgende PCR-amplificatie en wordt gepaard met thymine (T)5mC, daarentegen, beschermd door zijn methylgroep, blijft volledig ongewijzigd als C.

Deze stap transformeert slim wat oorspronkelijk een onzichtbare epigenetische modificatie was in een zichtbaar basisequentieverschil (een verandering van C naar T),tot vaststelling van de grondslag voor de specifieke erkenning van qPCR.

Zodra de sequentieconversie is voltooid, vangt het qPCR-systeem methyleringssignalen op met zorgvuldig ontworpen primers en sondes.

• MS-qPCR / qMSP (Quantitative Methylation-Specific PCR):Voor omgezette sequenties worden twee sets primers apart ontworpen: één set past perfect bij de gemethyleerde sequentie (M-primers), terwijl de andere bij de niet-gemethyleerde sequentie (U-primers) past.qPCR versterkt en kwantificeert selectief de gemethyleerde sequenties.

  

• MethyLight:MethyLight is gebaseerd op MS-qPCR en bevat TaqMan-sondes (dubbel gelabelde sondes met een fluorophore en een blusmiddel).de exonuclease-activiteit van Taq DNA-polymerase hydrolyseert de sondeDoor de Cq-waarden tussen de kanalen te vergelijken, kan het precieze methyleringspercentage van de doelplaatsen worden berekend.het gemakkelijk onderscheiden van de status van individuele CpG-locaties.

  

Tijdens de qPCR-reactie controleert het instrument de ophoping van fluorescentie in realtime.

In de gegevensanalyse wordt meestal relatieve kwantificatie gebruikt: een huishoudelijk of referentiegeen dient als basislijn en het methyleringspercentage wordt berekend met behulp van de formule:

Als alternatief kunnen standaardcurven die zijn getekend met behulp van gemethyleerde normen van bekende concentraties de absolute methyleringsverhouding opleveren.

Met deze strenge logica kan qPCR gevoelige sporen van abnormale methyleringssignalen detecteren die zo laag zijn als 1% tot 5% in een monster.

• Hoge gevoeligheid:Kan methyleerde allelen detecteren tot 1%~5%.

• Precieze kwantificatie:Ideaal voor klinische monsters en ctDNA (celvrij DNA) met een lage input.

• Kosteneffectief:Een lagere kostprijs in vergelijking met NGS of digitaal PCR (dPCR), waardoor het ideaal is voor het valideren van enkele belangrijke CpG-locaties.

• Afhankelijk van omzetting:Ze zijn sterk afhankelijk van de efficiëntie van bisulfietconversie.

• Complexe primerontwerp:Een hoog GC-gehalte of dichte CpG-regio's maken het ontwerpen van de primer een uitdaging.

• Doelgroep:Geschikt alleen voor gerichte analyse van een paar locaties; niet ideaal voor genome-wide screening.

• Aanbevelingen voor controle:Bij elke partij moet altijd een positieve controle (volledig gemethyleerd DNA), een negatieve controle (volledig niet-gemethyleerd DNA) en een controle zonder sjabloon (NTC) worden uitgevoerd.