Применение одномолекулярного анализа FCS в разработке новой технологии разделения плазмы

Обзор исследования

В клинической диагностике и при тестировании в точке оказания медицинской помощи (POCT) быстрое отделение плазмы от цельной крови остается критически важной проблемой. Хотя традиционное центрифугирование высокоэффективно, оно не подходит для сценариев, требующих портативности, обработки сверхмалых объемов проб или автономного электропитания.

Для решения этой проблемы исследовательская группа под руководством профессора Ян Хуэй из Шэньчжэньского института передовых технологий Китайской академии наук опубликовала инновационное исследование в журнале Microsystems & Nanoengineering, предложив устройство для разделения плазмы без использования энергии, основанное на отрицательном магнитофорезе.

Основная инновация этого устройства заключается в его "двойном усиленном магнитной решетке Халбаха с чередующимися длинными и короткими полюсами." Эта конструкция обеспечивает эффективное, статическое разделение клеток крови от плазмы в цельной крови с помощью магнитных сил — без необходимости использования внешних источников питания или прецизионных насосов.

Команда подтвердила эффективность разделения экспериментами с образцами цельной крови крыс и человека. Они успешно применили устройство для быстрого обнаружения в симулированных анализах метаболизма лекарств (включая анализ концентрации флуоресцентных антител и гидродинамического радиуса) и обнаружения антител IgG к COVID-19. Результаты показали высокую степень соответствия с традиционным центрифугированием, демонстрируя, что это устройство предлагает недорогое, простое в эксплуатации решение для быстрого биохимического анализа в условиях ограниченных ресурсов.

Технология ФКС: "Золотой стандарт" для проверки качества разделения

Чтобы проверить, подходит ли плазма, отделенная методом отрицательного магнитофореза, для последующего фармакокинетического (ФК) анализа, исследовательская группа внедрила высокочувствительный метод обнаружения одиночных молекул: Спектроскопия флуоресцентной корреляции (ФКС).

Исследователи смешали меченые флуоресцентными красителями антитела в различных концентрациях (10 нМ, 20 нМ и 40 нМ) с цельной кровью крыс. Плазма была получена как методом отрицательного магнитофореза, так и стандартным двухступенчатым центрифугированием, после чего было проведено сравнительное исследование с использованием ФКС.

Основные выводы:

• Согласованность размеров частиц: Относительный гидродинамический радиус (значение $\tau_D$) антител, измеренный ФКС, показал высокую согласованность между двумя группами, с максимальным отклонением всего 14,1%. Это указывает на то, что процесс отрицательного магнитофореза исключительно бережен, не вызывает агрегации или деградации антител и сохраняет их нативную конформацию.

• Точность концентрации: Концентрации антител, измеренные обоими методами, были исключительно близки, с максимальным отклонением 16,3%. Это подтверждает, что отрицательный магнитофорез не вызывает специфической потери белка или неспецифического адсорбции.

Эти выводы убедительно доказывают, что разделение методом отрицательного магнитофореза достигает эквивалентного качества с "золотым стандартом" центрифугирования, предоставляя необходимые данные контроля качества для его применения в быстром и надежном мониторинге концентрации лекарств.

Рисунок 5: Результаты быстрого обнаружения симулированного метаболизма лекарств.

• a: Рабочий процесс тестирования метаболизма лекарств у крыс;

• b–d: Результаты обнаружения ФКС флуоресцентных антител в плазме, отделенной методом магнитного разделения по сравнению с центрифугированием при концентрациях антител (b) 10 нМ, (c) 20 нМ и (d) 40 нМ;

• e: Сравнение концентрации флуоресцентных антител и значений τD (метрика, связанная с гидродинамическим размером антител) в образцах плазмы после магнитного разделения по сравнению с центрифугированием.

Почему техническое преимущество ФКС незаменимо?

ФКС сыграла решающую роль арбитра в этом исследовании благодаря своим отличительным аналитическим возможностям:

1. Чувствительность к одиночным молекулам: Точно количественно определяет флуоресцентные молекулы в диапазоне от пМ до нМ, что значительно превосходит традиционные методы и делает его идеальным для отслеживания динамических концентраций лекарств in vivo.

2. Минимальные требования к образцу: Требуется всего 30 мкл плазмы на анализ. Это жизненно важно для исследований на мелких животных с жесткими ограничениями по объему крови, позволяя проводить многократные серийные отборы проб без ущерба для здоровья животных.

3. Измерение на месте без анализа: ФКС напрямую количественно определяет целевые молекулы посредством флуоресцентных флуктуаций в конфокальном объеме — даже в присутствии сложных белков, липидов или остаточных магнитных наночастиц — устраняя ошибки, связанные с очисткой, и потери при восстановлении.

4. Одновременный анализ концентрации и размера: Помимо концентрации, ФКС определяет коэффициенты диффузии (τD), которые служат ключевыми метриками для оценки состояния агрегации или деградации лекарств — аналитическое измерение, недостижимое с помощью базовой флуориметрии.

5. Быстрая высокопроизводительная производительность: Отдельные измерения завершаются всего за 10 секунд, что делает его хорошо подходящим для обработки образцов животных из нескольких временных точек и когорт в высокопроизводительных фармакокинетических исследованиях.

Значение исследования и перспективы применения ФКС

Это исследование является первой интеграцией усиленной двойной магнитной решетки Халбаха со статическим отрицательным магнитофорезом для создания поистине "пассивной, без насоса, высокоадаптивной" платформы для разделения плазмы. Оно преодолевает традиционную зависимость от внешнего питания и громоздкого оборудования, обеспечивая при этом превосходную эффективность разделения и совместимость с последующими анализами.

На протяжении всей этой работы ФКС служила незаменимым эталоном, предоставляя количественные доказательства надежности отрицательного магнитофореза и целостности образцов. Эта методологическая основа поддерживает будущие применения в области флуоресцентной фармакокинетики, обнаружения биомаркеров и мониторинга терапевтических лекарств (TDM). По мере того как обнаружение одиночных молекул становится более доступным, сочетание ФКС с портативными устройствами для разделения плазмы обещает открыть новое поколение минимально инвазивных, точечных и точных клинических диагностических решений.

О технологии ФКС

Спектроскопия флуоресцентной корреляции (ФКС) измеряет характеристики молекул/наночастиц — такие как молярная концентрация, яркость/состояние агрегации, коэффициент диффузии/гидродинамический радиус и сродство связывания (значения K_{) за считанные секунды.}) — с разрешением одиночных молекул в образцах микрообъема (~мкл) или живых клетках. Являясь гомогенным, на месте, высококонтентным аналитическим инструментом, ФКС полностью совместима с физиологическими матрицами (включая клеточные лизаты и цельную кровь).

ФКС и ее производные методы широко используются в исследовании клеточной сигнализации, жидкостно-жидкостного разделения фаз (LLPS), денатурации/агрегации биомолекул, механизмов структуры-функции, разработке нанолекарств, анализе экзосом, инженерии флуоресцентных зондов, скрининге антител/лекарств и микрофлюидике. На сегодняшний день в PubMed проиндексировано более 15 000 научных статей, использующих ФКС.

Об анализаторе молекулярных взаимодействий ФКС JLM-Lifetech

Анализатор молекулярных взаимодействий MIA Series FCS для кинетики одиночных молекул представляет собой сверхчувствительную платформу для одиночных молекул на основе спектроскопии флуоресцентной корреляции (ФКС). Обнаруживая флуктуации интенсивности флуоресценции в микроскопическом объеме наблюдения, он характеризует молекулярные взаимодействия и свойства на уровне одиночных молекул.Используя корреляционные алгоритмы для разрешения сигналов во временной области, система не требует этапов разделения или очистки (гомогенное обнаружение). При объемах образца всего в несколько десятков микролитров она обеспечивает высокопроизводительный количественный анализ концентрации, размера частиц, коэффициента диффузии и сродства связывания (K

D_{) за считанные секунды.}Основные области применения:

Открытие и разработка лекарств

• Клеточная биология

• Химия

• Биохимия и молекулярная биология

• Структурная биология

• Фотофизика