¿Por qué elegir la PCR digital para el análisis de variación del número de copias (CNV)?
El análisis de la variación del número de copias (CNV) es esencial para comprender la diversidad genética y los mecanismos de la enfermedad.Análisis de microarrays, y la secuenciación de próxima generación (NGS) se utilizan ampliamente, cada uno posee limitaciones inherentes:
- Cuantificación limitada:La FISH y la citometría de flujo ofrecen datos cuantificables restringidos en comparación con laPCR digital (dPCR), a menudo faltan micro-variaciones sutiles.
- Complejidad y coste:El NGS implica flujos de trabajo complejos y costes elevados, y con frecuencia se ve obstaculizado por repeticiones en tándem, un sello distintivo de muchos CNV.
- Los límites de sensibilidad: métodos basados en qPCR, aunque eficaces, se basan en curvas estándar y generalmente solo detectan variaciones mayores de dos veces.
Por el contrario,DPCRpermite verdaderoCuantificación absolutasin necesidad de curvas estándar, ofreciendo una sensibilidad lo suficientemente alta como para detectar variaciones tan bajas como el 10%.
La alta sensibilidad es crítica para los conocimientos clínicos, particularmente enAmplificación del gen HER2 (ERBB2)Ubicado en el cromosoma 17, HER2 actúa como un "acelerador celular". La amplificación anormal conduce a la sobreexpresión de la proteína HER2, lo que resulta en un crecimiento tumoral agresivo, tasas de recurrencia más altas,y peor pronóstico.
En los cánceres de mama inducidos por mutaciones somáticas, más del 20% de los casos presentan copias extras de HER2.que enmascara la señal CNVAquí es donde elalta sensibilidad de la dPCRLa evaluación precisa de los resultados es indispensable.
- Dilución y partición infinitas:Las muestras de ADN que contienen el blanco (HER2) y los genes de referencia están altamente diluidos y distribuidos en miles de microunidades independientes (gotas o nanoondas).Cada unidad contiene una o cero moléculas dianaEsto aísla a los objetivos raros del "ruido" de fondo y mitiga el impacto de los inhibidores de PCR.
- Amplificación de PCR paralela:La amplificación de PCR ocurre simultáneamente en todas las unidades independientes. Las unidades que contienen el ADN objetivo emiten una señal fluorescente (positiva), mientras que las que no lo son permanecen oscuras (negativas).
- Contado directo y estadísticas de Poisson:Contando particiones positivas y aplicandoModelos de distribución del pescado, la dPCR calcula la concentración absoluta de los genes HER2 y de referencia.Valor de la CNVLa relación entre los dos está determinada, eliminando así la necesidad de normas externas.
Figura 1: Diagrama esquemático de los principios de PCR digital.
En este flujo de trabajo (Figura 2), unensayo duplex de dPCRutiliza dos tintes fluorescentes para evaluarEl HER2y el gen de referenciaEl FEI5(se sabe que hay dos copias).
Como se muestra en la Figura 3, las particiones dPCR contienen HER2 (azul), EIF5 (verde) o ambos (rojo). A través de la distribución de Poisson, el software determina las concentraciones absolutas.El número de copias de HER2 de la muestra se calculó en aproximadamente2.92, capturando beneficios sutiles que los métodos tradicionales podrían pasar por alto.
Figura 2: Proceso simplificado de dPCR de múltiples objetivos (ensayo doble). Figura 3: Diagrama de dispersión 2D para el cálculo del CNV.
Figura 3: Diagrama de dispersión 2D para el cálculo del CNV.
La PCR digital es una tecnología de vanguardia basada en la amplificación de una sola molécula.
- Cuantificación absoluta verdadera:Obtener copias directas/μL sin curvas estándar.
- Ultra alta sensibilidad:Ideal para detectar mutaciones raras y biopsias de ADN líquido (ctDNA) donde las secuencias diana son extremadamente escasas.
- Alta tolerancia:La partición minimiza los efectos de los inhibidores de la PCR, lo que garantiza la confiabilidad en muestras biológicas complejas.
- Prejuicios minimizados:La eliminación de la competencia entre las moléculas objetivo garantiza resultados auténticos y reproducibles.
Aplicaciones del DPCR de JLM-Lifetech:
- Detección de secuencias raras (biopsia líquida)
- Análisis de la variación del número de copias (CNV)
- Detección de patógenos y vigilancia de la carga viral
- Cuantificación de la biblioteca NGS
- Detección de trazas de contaminantes
