لماذا تختار PCR الرقمية لتحليل اختلاف عدد النسخ (CNV) ؟

تحليل التباين في عدد النسخ (CNV) أمر ضروري لفهم التنوع الوراثي وآليات المرض. في حين أن الأساليب التقليدية مثل التهجين بالفلوريسانس في الموقع (FISH) ، قياس السيتومتر التدريجي ،تحليل المصفوفات الدقيقة، وتسلسل الجيل التالي (NGS) تستخدم على نطاق واسع، ولكل منها قيود متأصلة:

• كمية محدودة:تقدم FISH و Flow Cytometry بيانات محدودة قابلة للقياس الكمي مقارنةالـ PCR الرقمي (dPCR)، وغالبا ما تفتقر إلى الاختلافات الدقيقة.
• التعقيد والتكلفة:ويشمل نظام التشغيل الوطني سير العمل المعقد والتكاليف العالية، وغالبا ما يعوقه تكرار التنسيق، وهو سمة مميزة للعديد من الشركات المركزية.
• حدود الحساسية: الأساليب القائمة على qPCR، في حين أنها فعالة، تعتمد على المنحنيات القياسية وعادة ما تكتشف فقط الاختلافات أكبر من 2 أضعاف.

على النقيضdPCRيسمح بالحقالكمية المطلقةدون الحاجة إلى منحنيات قياسية، وتوفر حساسية عالية بما يكفي للكشف عن اختلافات منخفضة تصل إلى 10%.

الحساسية العالية حاسمة للفهم السريري، وخاصة فيتضخيم جين HER2 (ERBB2)يقع في الكروموسوم 17، HER2 يعمل كـ "مسرع خليوي". التضخيم غير الطبيعي يؤدي إلى زيادة التعبير عن بروتين HER2، مما يؤدي إلى نمو أورام عدواني، ومعدلات تكرار أعلى،والتشخيص أسوأ.

في سرطان الثدي الناجم عن الطفرات الجسدية، يظهر أكثر من 20% من الحالات نسخ إضافية من HER2. التحدي الرئيسي في خزعة الورم هو الوجود الكبير للخلايا الطبيعية داخل العينة،الذي يخفي إشارة CNVهنا حيثحساسية عالية لـ dPCRتصبح ضرورية لتقييم دقيق.

1. التخفيف اللامتناهي والتقسيم:يتم تخفيف عينات الحمض النووي التي تحتوي على الهدف (HER2) والجينات المرجعية بشكل كبير وتوزيعها على الآلاف من الوحدات الصغيرة المستقلة (قطرات أو نانو).كل وحدة تحتوي على جزيئ واحد أو صفر جزيئات هدفهذا يعزل الأهداف النادرة من "ضوضاء" الخلفية ويقلل من تأثير مثبطات PCR.
2. التضخم الموازي لـ PCR:يحدث تضخيم PCR في وقت واحد في جميع الوحدات المستقلة. تقوم الوحدات التي تحتوي على الحمض النووي المستهدف بإصدار إشارة لامعة (إيجابية) ، في حين تظل الوحدات التي لا تحتوي عليها مظلمة (سلبية).
3. العد المباشر وإحصاءات بويسون:من خلال حساب القسمات الإيجابية وتطبيقنماذج توزيع الأسماك، dPCR يحسب التركيز المطلق لكل من HER2 وجينات المرجعية.قيمة CNVيتم تحديدها بنسبة هذين الأمرين، مما يلغي الحاجة إلى معايير خارجية.

الشكل 1: رسم بياني لمبادئ PCR الرقمية.

في سير العمل هذا (الشكل 2) ،اختبار dPCR مزدوجيستخدم صبغين فلوروسنتين لتقييمHER2والجين المرجعيصندوق الاستثمار الأوروبي 5(من المعروف أن هناك نسختين).

كما هو موضح في الشكل 3، تحتوي مقسمات dPCR إما على HER2 (الأزرق) ، EIF5 (الأخضر) ، أو كليهما (الأحمر). من خلال توزيع بويسون، يحدد البرنامج التركيزات المطلقة. في هذا المثال،تم حساب عدد نسخة HER2 في العينة2.92، والحصول على مكاسب خفية قد تتجاهل الأساليب التقليدية.

الشكل 2: عملية dPCR متعددة الأهداف المبسطة (التحليل المزدوج). الشكل 3: مخطط انتشار 2D لحساب CNV.

الشكل 3: مخطط انتشار 2D لحساب CNV.

الـ PCR الرقمي هو تقنية متطورة تستند إلى تضخيم جزيء واحد. توفر حلول dPCR لـ JLM-Lifetech:

• الكم المطلق الحقيقي:الحصول على نسخ مباشرة/μL بدون منحنيات قياسية.
• حساسية فائقةمثالية للكشف عن الطفرات النادرة والخزعات السائلة (ctDNA) حيث تسلسلات الهدف نادرة للغاية.
• التسامح العالي:يقلل التقسيم من آثار مثبطات PCR ، مما يضمن الموثوقية في العينات البيولوجية المعقدة.
• الحد من التحيز:القضاء على المنافسة بين الجزيئات المستهدفة يضمن نتائج حقيقية وقابلة للتكرار.

تطبيقات JLM-Lifetech dPCR:

• الكشف عن تسلسل نادر (خزعة السائل)
• تحليل تغير عدد النسخ (CNV)
• الكشف عن المسببات الأمراضية ومراقبة الحمل الفيروسي
• كمية مكتبة NGS
• اكتشاف آثار الملوثات