Waarom kiezen voor digitale PCR voor kopiecijfervariatie (CNV) -analyse?

Copy Number Variation (CNV)-analyse is essentieel voor het begrijpen van genetische diversiteit en ziektemechanismen. Hoewel traditionele methoden zoals Fluorescentie In Situ Hybridisatie (FISH), Flowcytometrie, Microarray-analyse en Next-Generation Sequencing (NGS) op grote schaal worden gebruikt, hebben ze elk inherente beperkingen:

• Beperkte kwantificering:FISH en Flowcytometrie bieden beperkte kwantificeerbare gegevens vergeleken metdigitale PCR (dPCR), waarbij vaak subtiele microvariaties ontbreken.
• Complexiteit en kosten:NGS brengt ingewikkelde workflows en hoge kosten met zich mee, en wordt vaak gehinderd door tandemherhalingen – een kenmerk van veel CNV's.
• Gevoeligheidsdrempels: qPCR-gebaseerde methodenHoewel ze effectief zijn, vertrouwen ze op standaardcurven en detecteren ze doorgaans alleen variaties die groter zijn dan het dubbele.

DaarentegendPCRmaakt waar mogelijkabsolute kwantificeringzonder de noodzaak van standaardcurven, met een gevoeligheid die hoog genoeg is om variaties van slechts 10% te detecteren.

Hoge gevoeligheid is van cruciaal belang voor klinische inzichten, vooral inHER2 (ERBB2) genamplificatie. Gelegen op chromosoom 17, fungeert HER2 als een ‘cellulaire versneller’. Abnormale amplificatie leidt tot overexpressie van het HER2-eiwit, resulterend in agressieve tumorgroei, hogere recidiefpercentages en een slechtere prognose.

Bij door somatische mutaties veroorzaakte borstkanker vertoont meer dan 20% van de gevallen extra HER2-kopieën. Een grote uitdaging bij tumorbiopsie is de grote aanwezigheid van normale cellen in het monster, die het CNV-signaal maskeren. Dit is waar dehoge gevoeligheid van dPCRonmisbaar wordt voor een nauwkeurige beoordeling.

1. Oneindige verdunning en verdeling:DNA-monsters die de doelgenen (HER2) en referentiegenen bevatten, zijn sterk verdund en verdeeld over duizenden onafhankelijke micro-eenheden (druppeltjes of nanowells). Idealiter bevat elke eenheid één of nul doelmoleculen. Dit isoleert zeldzame doelwitten van achtergrondruis en verzacht de impact van PCR-remmers.
2. Parallelle PCR-amplificatie:PCR-amplificatie vindt gelijktijdig plaats in alle onafhankelijke eenheden. Eenheden die het doel-DNA bevatten, zenden een fluorescerend signaal uit (positief), terwijl eenheden zonder doel-DNA donker blijven (negatief).
3. Direct tellen en Poisson-statistieken:Door positieve partities te tellen en toe te passenPoisson-distributiemodellenberekent dPCR de absolute concentratie van zowel HER2- als referentiegenen. De finaleCNV-waardewordt bepaald door de verhouding tussen de twee, waardoor de noodzaak voor externe standaarden wordt geëlimineerd.

Figuur 1: Schematisch diagram van digitale PCR-principes.

In deze workflow (Figuur 2), aduplex dPCR-testgebruikt twee fluorescerende kleurstoffen om te evaluerenHER2en het referentiegenEIF5(bekend dat er twee exemplaren zijn).

Zoals weergegeven in Figuur 3 bevatten dPCR-partities HER2 (blauw), EIF5 (groen) of beide (rood). Via Poisson-distributie bepaalt de software absolute concentraties. In dit voorbeeld werd het HER2-kopienummer van het monster berekend op ongeveer2,92, waarbij subtiele voordelen worden vastgelegd die traditionele methoden over het hoofd zouden kunnen zien.

Figuur 2: Vereenvoudigd Multi-target dPCR-proces (Duplex Assay). Figuur 3: 2D-spreidingsdiagram voor CNV-berekening.

Figuur 3: 2D-spreidingsdiagram voor CNV-berekening.

Digitale PCR is een geavanceerde technologie gebaseerd op amplificatie van één molecuul. De dPCR-oplossingen van JLM-Lifetech bieden:

• Echte absolute kwantificering:Verkrijg directe kopieën/μL zonder standaardcurven.
• Ultrahoge gevoeligheid:Ideaal voor het detecteren van zeldzame mutaties en vloeibare biopsieën (ctDNA) waarbij doelsequenties uiterst schaars zijn.
• Hoge tolerantie:Partitionering minimaliseert de effecten van PCR-remmers, waardoor de betrouwbaarheid van complexe biologische monsters wordt gegarandeerd.
• Geminimaliseerde bias:Het elimineren van concurrentie tussen doelmoleculen zorgt voor authentieke en reproduceerbare resultaten.

Toepassingen van JLM-Lifetech dPCR:

• Detectie van zeldzame sequenties (vloeistofbiopsie)
• Kopieer nummervariatie (CNV) analyse
• Pathogeendetectie en monitoring van virale belasting
• Kwantificering van de NGS-bibliotheek
• Detectie van sporenverontreinigingen