Perché scegliere la PCR digitale per l'analisi della variazione del numero di copie (CNV)?

L'analisi della variazione del numero di copie (CNV) è essenziale per comprendere la diversità genetica e i meccanismi delle malattie. Sebbene i metodi tradizionali come l'ibridazione in situ fluorescente (FISH), la citometria a flusso, l'analisi di microarray e il sequenziamento di nuova generazione (NGS) siano ampiamente utilizzati, ciascuno di essi possiede limitazioni intrinseche:

• Quantificazione limitata:La FISH e la citometria a flusso offrono dati quantificabili limitati rispetto aPCR digitale (dPCR), spesso mancano sottili microvariazioni.
• Complessità e costi:L'NGS comporta flussi di lavoro complessi e costi elevati ed è spesso ostacolato dalle ripetizioni in tandem, un tratto distintivo di molte CNV.
• Soglie di sensibilità: Metodi basati su qPCR, sebbene efficaci, si basano su curve standard e in genere rilevano solo variazioni superiori a 2 volte.

Al contrario,dPCRabilita veroquantificazione assolutasenza la necessità di curve standard, offrendo una sensibilità sufficientemente elevata da rilevare variazioni fino al 10%.

L'elevata sensibilità è fondamentale per gli approfondimenti clinici, in particolare inAmplificazione del gene HER2 (ERBB2).. Situato sul cromosoma 17, HER2 agisce come un "acceleratore cellulare". L'amplificazione anomala porta alla sovraespressione della proteina HER2, con conseguente crescita aggressiva del tumore, tassi di recidiva più elevati e prognosi peggiore.

Nei tumori al seno guidati da mutazioni somatiche, oltre il 20% dei casi presenta copie extra di HER2. Una sfida importante nella biopsia tumorale è la forte presenza di cellule normali all’interno del campione, che maschera il segnale CNV. Questo è dove ilelevata sensibilità della dPCRdiventa indispensabile per una valutazione precisa.

1. Diluizione infinita e partizionamento:I campioni di DNA contenenti il ​​bersaglio (HER2) e i geni di riferimento sono altamente diluiti e distribuiti in migliaia di microunità indipendenti (goccioline o nanopozzetti). Idealmente, ciascuna unità contiene una o zero molecole bersaglio. Ciò isola i bersagli rari dal "rumore" di fondo e mitiga l'impatto degli inibitori della PCR.
2. Amplificazione PCR parallela:L'amplificazione della PCR avviene simultaneamente in tutte le unità indipendenti. Le unità contenenti il ​​DNA bersaglio emettono un segnale fluorescente (positivo), mentre quelle prive rimangono scure (negativo).
3. Conteggio diretto e statistiche di Poisson:Contando le partizioni positive e applicandoModelli di distribuzione di Poisson, dPCR calcola la concentrazione assoluta sia di HER2 che dei geni di riferimento. La finaleValore CNVè determinato dal rapporto tra i due, eliminando la necessità di standard esterni.

Figura 1: diagramma schematico dei principi della PCR digitale.

In questo flusso di lavoro (Figura 2), asaggio dPCR duplexutilizza due coloranti fluorescenti per valutareHER2e il gene di riferimentoFEI5(noto per avere due copie).

Come mostrato nella Figura 3, le partizioni dPCR contengono HER2 (blu), EIF5 (verde) o entrambi (rosso). Attraverso la distribuzione di Poisson, il software determina le concentrazioni assolute. In questo esempio, il numero di copie HER2 del campione è stato calcolato approssimativamente a2.92, cogliendo sottili vantaggi che i metodi tradizionali potrebbero trascurare.

Figura 2: Processo dPCR multi-target semplificato (saggio duplex). Figura 3: Grafico a dispersione 2D per il calcolo del CNV.

Figura 3: Grafico a dispersione 2D per il calcolo del CNV.

La PCR digitale è una tecnologia all’avanguardia basata sull’amplificazione di singole molecole. Le soluzioni dPCR di JLM-Lifetech offrono:

• Vera quantificazione assoluta:Ottenere copie dirette/μL senza curve standard.
• Sensibilità ultraelevata:Ideale per rilevare mutazioni rare e biopsie liquide (ctDNA) in cui le sequenze target sono estremamente scarse.
• Alta tolleranza:Il partizionamento riduce al minimo gli effetti degli inibitori della PCR, garantendo l'affidabilità nei campioni biologici complessi.
• Distorsione ridotta al minimo:L'eliminazione della competizione tra le molecole bersaglio garantisce risultati autentici e riproducibili.

Applicazioni del dPCR di JLM-Lifetech:

• Rilevamento di sequenze rare (biopsia liquida)
• Analisi della variazione del numero di copie (CNV).
• Rilevamento di agenti patogeni e monitoraggio della carica virale
• Quantificazione della libreria NGS
• Rilevamento di tracce di contaminanti