왜 복사량 변동 (CNV) 분석을 위해 디지털 PCR를 선택합니까?
복사 수 변동 (CNV) 분석은 유전자 다양성과 질병 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다.마이크로어레이 분석, 다음 세대 염기서열 (NGS) 이 널리 사용되고 있지만, 각각은 고유 한 한계를 가지고 있습니다.
- 제한된 수치:FISH 및 흐름 사이토메트리는디지털 PCR (dPCR), 종종 미세한 미세한 변이가 없습니다.
- 복잡성 및 비용:NGS는 복잡한 작업 흐름과 높은 비용을 포함하며 종종 많은 CNV의 특징인 탕데임 반복에 의해 방해됩니다.
- 감수성 기준: qPCR 기반 방법, 효과적이지만 표준 곡선에 의존하고 일반적으로 2배 이상의 변동만을 감지합니다.
반대로,dPCRtrue를 허용합니다절대적인 수치표준 곡선이 필요하지 않고, 10%의 변동까지 감지할 수 있을 정도로 높은 감도를 제공합니다.
높은 감수성은 임상 통찰력, 특히HER2 (ERBB2) 유전자 증폭염색체 17에 위치한 HER2는 "세포 가속기"로 작용합니다. 비정상적인 증폭은 HER2 단백질 과잉 발현으로 이어지며 공격적인 종양 성장, 더 높은 재발률,그리고 더 나쁜 예후.
소마틱 돌연변이로 인한 유방암의 경우, 20% 이상의 경우 HER2 복사본이 추가로 나타납니다. 종양 생검의 주요 과제는 샘플 내에서 정상적인 세포가 많이 존재한다는 것입니다.CNV 신호를 감추는여기가 바로dPCR의 높은 민감도정확한 평가를 위해 필수적입니다.
- 무한 희석 및 분할:표적 (HER2) 및 참조 유전자를 포함하는 DNA 샘플은 수천 개의 독립적인 마이크로 유닛 (방울 또는 나노 웰) 에 걸쳐 매우 희석되고 분산됩니다.각 단위는 1개 또는 0개의 목표 분자를 포함합니다.이것은 희귀한 표적을 배경 "소음"으로부터 격리하고 PCR 억제제의 영향을 완화합니다.
- 병행 PCR 증폭:PCR 증폭은 모든 독립적인 단위에서 동시에 발생합니다. 대상 DNA를 포함하는 단위는 형광 신호를 방출합니다 (긍정적), 그렇지 않은 단위는 어두운 상태로 남아 있습니다 (부정적).
- 직접 계산 & 포이슨 통계:양분열을 계산하고물고기 분포 모델, dPCR는 HER2와 참조 유전자의 절대 농도를 계산합니다.CNV 값이 두 가지의 비율에 의해 결정되며 외부 표준의 필요성을 제거합니다.
그림 1: 디지털 PCR 원리의 스케마적 다이어그램
이 작업 흐름에서 (그림 2)듀플렉스 dPCR 검사두 개의 형광 염료를 사용하여HER2그리고 기준 유전자EIF5(두 개의 복사본이 있는 것으로 알려져 있습니다.)
그림 3에서 보이는 것처럼, dPCR 파티션은 HER2 (파란색), EIF5 (녹색) 또는 둘 다 (붉은) 를 포함합니다. 포이슨 분포를 통해 소프트웨어는 절대 농도를 결정합니다. 이 예에서,샘플의 HER2 복사본 수가2.92, 전통적인 방법이 간과할 수 있는 미묘한 이득을 포착합니다.
그림 2: 단순화된 다목적 dPCR (Duplex Assay) 과정 그림 3: CNV 계산을 위한 2차원 스캐터 그래프.
그림 3: CNV 계산을 위한 2차원 스캐터 그래프.
디지털 PCR는 단일 분자 증폭을 기반으로 한 최첨단 기술입니다. JLM-Lifetech의 dPCR 솔루션은 다음과 같습니다.
- 진정한 절대 정량화:표준 곡선 없이 직접 복사/μL를 얻는다.
- 초고 감수성:희귀한 돌연변이 및 액체 생체검사 (ctDNA) 를 탐지하는데 이상적입니다. 대상 염기서열이 극히 희귀한 곳이죠.
- 높은 내성:분할은 PCR 억제제의 효과를 최소화하여 복잡한 생물학적 표본의 신뢰성을 보장합니다.
- 최소화된 편견:목표 분자 간의 경쟁을 제거하면 진실하고 재생 가능한 결과를 보장합니다.
JLM-Lifetech dPCR의 적용:
- 희귀 염기서열 검출 (액성 생검)
- 복사자 수 변동 (CNV) 분석
- 병원체 검출 및 바이러스 부하 모니터링
- NGS 라이브러리 정량화
- 흔적 오염물질 탐지
