L'analyse de la variation du nombre de copies (CNV) est essentielle pour comprendre la diversité génétique et les mécanismes de la maladie.Analyse par microarray, et le séquençage de prochaine génération (NGS) sont largement utilisés, ils possèdent chacun des limitations inhérentes:

• Quantification limitée:La FISH et la cytométrie de débit offrent des données quantifiables limitées par rapport àPCR numérique (dPCR), souvent manquant de micro-variations subtiles.
• Complicité et coût:Le NGS implique des flux de travail complexes et des coûts élevés, et est souvent entravé par des répétitions en tandem, caractéristique de nombreuses CNV.
• seuils de sensibilité: méthodes basées sur la qPCR, bien qu'efficaces, reposent sur des courbes standard et ne détectent généralement que des variations supérieures à 2 fois.

Au contraire,dPCRpermet vraiquantification absoluesans avoir besoin de courbes standard, offrant une sensibilité suffisamment élevée pour détecter des variations aussi faibles que 10%.

Une sensibilité élevée est essentielle pour les connaissances cliniques, en particulier dans leAmplification du gène HER2 (ERBB2)Situé sur le chromosome 17, le HER2 agit comme un "accélérateur cellulaire". Une amplification anormale conduit à une surexpression de la protéine HER2, entraînant une croissance tumorale agressive, des taux de récidive plus élevés,et un pronostic plus faible.

Dans les cancers du sein induits par des mutations somatiques, plus de 20% des cas présentent des copies supplémentaires de HER2.qui masque le signal CNVC' est ici que leune sensibilité élevée de la dPCRIl devient indispensable pour une évaluation précise.

1. Dilution et séparation infinies:Les échantillons d'ADN contenant la cible (HER2) et les gènes de référence sont très dilués et répartis sur des milliers de micro-unités indépendantes (gouttelettes ou nano-vagues).chaque unité contient une ou zéro molécule cibleCela isole les cibles rares du "bruit" de fond et atténue l'impact des inhibiteurs de la PCR.
2. Amplification parallèle par PCR:L'amplification par PCR se produit simultanément dans toutes les unités indépendantes. Les unités contenant l'ADN cible émettent un signal fluorescent (positif), tandis que celles qui ne le sont pas restent sombres (négatives).
3. Compte direct et statistiques de Poisson:En comptant les partitions positives et en appliquantModèles de répartition des poissons, la dPCR calcule la concentration absolue des gènes HER2 et de référence.Valeur de la CNVest déterminée par le rapport des deux, ce qui élimine le besoin de normes externes.

Figure 1: Diagramme schématique des principes de la PCR numérique.

Dans ce flux de travail (Figure 2), untest dPCR en doubleutilise deux colorants fluorescents pour évaluerHER2et le gène de référenceLe FIE5(il est connu qu'il existe deux exemplaires).

Comme le montre la figure 3, les partitions dPCR contiennent soit HER2 (bleu), EIF5 (vert), ou les deux (rouge).le nombre de copies HER2 de l'échantillon a été calculé à environ2.92, capturant des gains subtils que les méthodes traditionnelles pourraient négliger.

Figure 2: procédé simplifié de dPCR à cibles multiples (duplex assay). Figure 3: Graphique de dispersion 2D pour le calcul de la CNV.

Figure 3: Graphique de dispersion 2D pour le calcul de la CNV.

La PCR numérique est une technologie de pointe basée sur l'amplification d'une seule molécule.

• Véritable quantification absolue:Obtenir des copies directes/μL sans courbes standard.
• Sensitivité extrêmement élevée:Idéal pour détecter les mutations rares et les biopsies liquides (ctDNA) où les séquences cibles sont extrêmement rares.
• Tolérance élevée:La partition minimise les effets des inhibiteurs de la PCR, assurant ainsi la fiabilité des échantillons biologiques complexes.
• Bias réduit:L'élimination de la concurrence entre les molécules cibles assure des résultats authentiques et reproductibles.

Applications du DPCR de JLM-Lifetech:

• Détection de séquences rares (biopsie liquide)
• Analyse de la variation du nombre de copies
• Détection des agents pathogènes et surveillance de la charge virale
• Quantification de la bibliothèque NGS
• Détection des traces de contaminants