コピー数多型 (CNV) 解析は、遺伝的多様性と疾患メカニズムを理解するために不可欠です。蛍光 In Situ ハイブリダイゼーション (FISH)、フローサイトメトリー、マイクロアレイ解析、次世代シーケンシング (NGS) などの従来の方法が広く使用されていますが、それぞれに固有の制限があります。

• 限られた定量化:FISH およびフローサイトメトリーは、他の方法と比べて定量化可能なデータが制限されています。デジタル PCR (dPCR)、微妙な微小な変化が見逃されることがよくあります。
• 複雑さとコスト:NGS には複雑なワークフローと高いコストが伴い、多くの CNV の特徴であるタンデム反復によって妨げられることがよくあります。
• 感度のしきい値: qPCR ベースの方法は効果的ではありますが、標準曲線に依存しており、通常は 2 倍を超える変動のみを検出します。

対照的に、dPCRtrue を有効にする絶対定量化標準曲線を必要とせず、わずか 10% の変動を検出するのに十分な高い感度を提供します。

高感度は、特に臨床的洞察にとって重要です。HER2 (ERBB2) 遺伝子の増幅。 HER2 は 17 番染色体に位置し、「細胞加速器」として機能します。異常な増幅は HER2 タンパク質の過剰発現を引き起こし、その結果、腫瘍の増殖が促進され、再発率が高まり、予後が不良になります。

体細胞変異による乳がんでは、20% 以上の症例で余分な HER2 コピーが見られます。腫瘍生検における主な課題は、サンプル内に正常細胞が大量に存在し、CNV シグナルが隠蔽されてしまうことです。ここは、dPCRの高感度正確な評価には欠かせません。

1. 無限の希釈と分割:標的遺伝子 (HER2) と参照遺伝子を含む DNA サンプルは高度に希釈され、数千の独立したマイクロユニット (液滴またはナノウェル) に分散されます。理想的には、各ユニットにはターゲット分子が 1 つまたはゼロのいずれかが含まれます。これにより、まれなターゲットがバックグラウンドの「ノイズ」から分離され、PCR 阻害剤の影響が軽減されます。
2. パラレル PCR 増幅:PCR 増幅はすべての独立したユニットで同時に行われます。ターゲット DNA を含むユニットは蛍光シグナル (ポジティブ) を発しますが、ターゲット DNA を含まないユニットは暗いままです (ネガティブ)。
3. 直接計数とポアソン統計:正のパーティションを数えて適用することにより、ポアソン分布モデル, dPCR は、HER2 遺伝子と参照遺伝子の両方の絶対濃度を計算します。決勝戦CNV値は 2 つの比率によって決定されるため、外部標準は必要ありません。

図 1: デジタル PCR の原理の概略図。

このワークフロー (図 2) では、二重 dPCR アッセイ2 つの蛍光色素を使用して評価しますHER2そして参照遺伝子EIF5(2 つのコピーがあることが知られています)。

図 3 に示すように、dPCR パーティションには HER2 (青)、EIF5 (緑)、または両方 (赤) が含まれています。ソフトウェアはポアソン分布を通じて絶対濃度を決定します。この例では、サンプルの HER2 コピー数はおよそ2.92、従来の方法では見落としがちな微妙な利益を捉えます。

図 2: 簡略化されたマルチターゲット dPCR (二重アッセイ) プロセス。 図 3: CNV 計算用の 2D 散布図。

図 3: CNV 計算用の 2D 散布図。

デジタル PCR は、単一分子増幅に基づいた最先端のテクノロジーです。 JLM-Lifetech の dPCR ソリューションは以下を提供します。

• 真の絶対定量化:標準曲線を使用せずに直接コピー/μL を取得します。
• 超高感度:ターゲット配列が非常に少ない場合の稀な変異やリキッドバイオプシー (ctDNA) の検出に最適です。
• 高い耐性:分割により PCR 阻害剤の影響が最小限に抑えられ、複雑な生体サンプルの信頼性が確保されます。
• 最小化されたバイアス:標的分子間の競合を排除することで、本物で再現可能な結果が保証されます。

JLM-Lifetech dPCR のアプリケーション:

• レアシーケンス検出 (リキッドバイオプシー)
• コピー数多型 (CNV) 解析
• 病原体の検出とウイルス量の監視
• NGS ライブラリの定量化
• 微量汚染物質の検出