A análise da variação do número de cópias (CNV) é essencial para compreender a diversidade genética e os mecanismos da doença.Análise de microarrays, e Next-Generation Sequencing (NGS) são amplamente usados, cada um deles possui limitações inerentes:

• Quantificação limitada:A FISH e a Flow Cytometry oferecem dados quantificáveis restritos em comparação com aPCR digital (dPCR), muitas vezes faltando micro-variações sutis.
• Complexidade e custo:O NGS envolve fluxos de trabalho complexos e custos elevados, e é frequentemente dificultado por repetições em tándem, característica de muitas CNVs.
• Prazos de sensibilidade: Métodos baseados em qPCR, apesar de eficazes, baseiam-se em curvas padrão e normalmente só detectam variações superiores a 2 vezes.

Em contraste,dPCRpermite verdadeQuantificação absolutasem necessidade de curvas padrão, oferecendo uma sensibilidade suficientemente elevada para detectar variações tão baixas como 10%.

A alta sensibilidade é crítica para os resultados clínicos, particularmente emAmplificação do gene HER2 (ERBB2)Localizado no cromossomo 17, o HER2 atua como um "acelerador celular". A amplificação anormal leva à sobre-expressão da proteína HER2, resultando em crescimento agressivo do tumor, maiores taxas de recorrência,e prognóstico mais precário.

Em cânceres de mama causados por mutações somáticas, mais de 20% dos casos apresentam cópias extras de HER2.que mascara o sinal CNVÉ aqui que oalta sensibilidade da dPCRA avaliação precisa é indispensável.

1. Dilução e partição infinitas:As amostras de ADN que contêm o alvo (HER2) e os genes de referência são altamente diluídos e distribuídos em milhares de micro-unidades independentes (gotas ou nano-bolhas).Cada unidade contém uma ou zero moléculas-alvoIsto isola alvos raros do "ruído" de fundo e mitiga o impacto dos inibidores da PCR.
2. Amplificação de PCR paralela:A amplificação da PCR ocorre simultaneamente em todas as unidades independentes. As unidades que contêm o DNA alvo emitem um sinal fluorescente (positivo), enquanto as que não têm permanecem escuras (negativas).
3. Contagem direta e estatísticas de Poisson:Contando divisórias positivas e aplicandoModelos de distribuição dos peixes, a dPCR calcula a concentração absoluta de genes HER2 e de referência.Valor do CNVA norma de qualidade é determinada pela relação entre os dois, eliminando a necessidade de normas externas.

Figura 1: Diagrama esquemático dos princípios da PCR digital.

Neste fluxo de trabalho (Figura 2), umAnálise dupla de dPCRutiliza dois corantes fluorescentes para avaliarHER2e o gene de referênciaFEE5(conhecido por ter duas cópias).

Como mostrado na Figura 3, as partições dPCR contêm HER2 (Azul), EIF5 (Verde) ou ambos (Vermelho). Através da distribuição de Poisson, o software determina concentrações absolutas.O número de cópias HER2 da amostra foi calculado a aproximadamente2.92, capturando ganhos sutis que os métodos tradicionais podem ignorar.

Figura 2: Processo simplificado de dPCR multi-alvo (análise dupla). Figura 3: Gráfico de difusão 2D para o cálculo do CNV.

Figura 3: Gráfico de difusão 2D para o cálculo do CNV.

A PCR digital é uma tecnologia de ponta baseada na amplificação de uma única molécula.

• Quantificação absoluta verdadeira:Obter cópias directas/μL sem curvas padrão.
• Ultra- Alta sensibilidade:Ideal para a detecção de mutações raras e biópsias líquidas (ctDNA) onde as sequências alvo são extremamente escassas.
• Tolerância elevada:A partição minimiza os efeitos dos inibidores da PCR, garantindo a confiabilidade em amostras biológicas complexas.
• Bias minimizados:A eliminação da concorrência entre as moléculas alvo garante resultados autênticos e reproduzíveis.

Aplicações do JLM-Lifetech dPCR:

• Detecção de sequências raras (biópsia líquida)
• Análise da variação do número de cópias (CNV)
• Detecção de patógenos e monitorização da carga viral
• Quantificação da Biblioteca NGS
• Detecção de vestígios de contaminantes