Die Analyse der Kopienzahlvariation (CNV) ist für das Verständnis der genetischen Vielfalt und der Krankheitsmechanismen unerlässlich.Mikroarray-Analyse, und Next-Generation Sequencing (NGS) sind weit verbreitet, sie besitzen jeweils inhärente Einschränkungen:

• Begrenzte Quantifizierung:FISH und Flow Cytometry bieten im Vergleich zudigitale PCR (dPCR), oft fehlen subtile Mikrovariationen.
• Komplexität und Kosten:NGS beinhaltet komplizierte Arbeitsabläufe und hohe Kosten und wird häufig durch Tandem-Wiederholungen behindert - ein Kennzeichen vieler CNVs.
• Empfindlichkeitsschwellenwerte: qPCR-basierte Methoden, die zwar wirksam sind, aber auf Standardkurven beruhen und in der Regel nur mehr als zweimal so große Schwankungen erkennen.

Im Gegensatz dazudPCRErmöglicht wahrabsolute Quantifizierungohne die Notwendigkeit von Standardkurven, die eine Empfindlichkeit bieten, die hoch genug ist, um Schwankungen von bis zu 10% zu erkennen.

Eine hohe Empfindlichkeit ist für klinische Erkenntnisse von entscheidender Bedeutung, insbesondere beiHer2 (ERBB2) -GenamplifikationDie abnormale Verstärkung führt zur Überexpression des HER2-Proteins, was zu aggressivem Tumorwachstum, höheren Rezidivraten,und schlechtere Prognose.

Bei somatisch-mutationsbedingten Brustkrebs weisen über 20% der Fälle zusätzliche HER2-Kopien auf.die das CNV-Signal verdecktDas ist der Ort, wo diehohe Empfindlichkeit der dPCREs ist nicht möglich, eine genaue Beurteilung vorzunehmen.

1. Unendliche Verdünnung und Trennung:DNA-Proben, die das Ziel (HER2) und die Referenzgene enthalten, werden stark verdünnt und auf Tausende unabhängiger Mikro-Einheiten (Tropfen oder Nanowellen) verteilt.jede Einheit entweder ein oder keine Zielmoleküle enthältDies isoliert seltene Ziele von Hintergrundlärm und mindert die Wirkung von PCR-Inhibitoren.
2. Parallele PCR-Verstärkung:Die PCR-Verstärkung erfolgt gleichzeitig in allen unabhängigen Einheiten. Einheiten, die die Ziel-DNA enthalten, emittieren ein fluoreszierendes Signal (positiv), während diejenigen ohne dunkel bleiben (negativ).
3. Direktes Zählen und Poisson-Statistiken:Durch die Zählung der positiven Trennungen und die AnwendungVerteilungsmodelle für Fische, berechnet dPCR die absolute Konzentration sowohl der HER2- als auch der Referenzgene.CNV-WertDer Anteil der Daten an der Datenbank wird durch das Verhältnis der beiden ermittelt, wodurch die Notwendigkeit externer Normen beseitigt wird.

Abbildung 1: Schematisches Diagramm der digitalen PCR-Grundsätze.

In diesem Arbeitsablauf (Abbildung 2) wird einDuplex-dPCR-Analyseverwendet zwei fluoreszierende Farbstoffe, um zu bewertenHer2und das ReferenzgenEIF5(bekanntlich in zwei Exemplaren).

Wie in Abbildung 3 gezeigt, enthalten dPCR-Partitionen entweder HER2 (blau), EIF5 (grün) oder beide (rot).Die HER2-Kopienzahl der Probe wurde bei2.92, die subtile Gewinne erfassen, die mit herkömmlichen Methoden übersehen werden.

Abbildung 2: Vereinfachtes Multi-Target-dPCR-Verfahren (Duplex-Assay). Abbildung 3: 2D-Scatter-Grafik zur Berechnung des CNV.

Abbildung 3: 2D-Scatter-Grafik zur Berechnung des CNV.

Die digitale PCR ist eine hochmoderne Technologie, die auf der Verstärkung einzelner Moleküle basiert.

• Wahre absolute Quantifizierung:Es werden direkte Kopien/μL ohne Standardkurven gewonnen.
• Ultraschwere Empfindlichkeit:Ideal für den Nachweis seltener Mutationen und flüssiger Biopsien (ctDNA), bei denen Zielsequenzen extrem knapp sind.
• Hohe Toleranz:Die Partitionierung minimiert die Wirkung von PCR-Hemmern und gewährleistet die Zuverlässigkeit komplexer biologischer Proben.
• Minimierte Verzerrung:Durch die Beseitigung des Wettbewerbs zwischen den Zielmolekülen werden authentische und reproduzierbare Ergebnisse gewährleistet.

Anwendungen von JLM-Lifetech dPCR:

• Rare Sequenz-Erkennung (Flüssigkeitsbiopsie)
• Analyse der Variation der Kopienzahl (CNV)
• Erkennung von Krankheitserregern und Überwachung der Viruslast
• NGS Bibliotheksquantifizierung
• Nachweis von Spuren von Schadstoffen