El análisis de variación del número de copias (CNV) es esencial para comprender la diversidad genética y los mecanismos de las enfermedades. Si bien los métodos tradicionales como la hibridación in situ por fluorescencia (FISH), la citometría de flujo, el análisis de microarrays y la secuenciación de próxima generación (NGS) se utilizan ampliamente, cada uno de ellos posee limitaciones inherentes:

• Cuantificación limitada:FISH y citometría de flujo ofrecen datos cuantificables restringidos en comparación conPCR digital (dPCR), a menudo faltan microvariaciones sutiles.
• Complejidad y costo:NGS implica flujos de trabajo complejos y costos elevados, y con frecuencia se ve obstaculizado por repeticiones en tándem, un sello distintivo de muchas CNV.
• Umbrales de sensibilidad: Métodos basados ​​en qPCR, si bien son eficaces, se basan en curvas estándar y normalmente solo detectan variaciones superiores al doble.

En contraste,dPCRpermite verdaderocuantificación absolutasin necesidad de curvas estándar, ofreciendo una sensibilidad lo suficientemente alta como para detectar variaciones tan bajas como el 10%.

La alta sensibilidad es fundamental para los conocimientos clínicos, especialmente enAmplificación del gen HER2 (ERBB2). Ubicado en el cromosoma 17, HER2 actúa como un "acelerador celular". La amplificación anormal conduce a la sobreexpresión de la proteína HER2, lo que resulta en un crecimiento tumoral agresivo, mayores tasas de recurrencia y un peor pronóstico.

En los cánceres de mama somáticos provocados por mutaciones, más del 20% de los casos presentan copias adicionales de HER2. Un desafío importante en la biopsia de tumores es la gran presencia de células normales dentro de la muestra, que enmascara la señal de CNV. Aquí es donde elalta sensibilidad de dPCRse vuelve indispensable para una evaluación precisa.

1. Dilución y partición infinitas:Las muestras de ADN que contienen los genes diana (HER2) y de referencia están altamente diluidas y distribuidas en miles de microunidades independientes (gotitas o nanopocillos). Idealmente, cada unidad contiene una o ninguna molécula objetivo. Esto aísla objetivos raros del "ruido" de fondo y mitiga el impacto de los inhibidores de la PCR.
2. Amplificación por PCR en paralelo:La amplificación por PCR se produce simultáneamente en todas las unidades independientes. Las unidades que contienen el ADN objetivo emiten una señal fluorescente (positiva), mientras que las que no la contienen permanecen oscuras (negativa).
3. Conteo directo y estadísticas de Poisson:Contando particiones positivas y aplicandoModelos de distribución de Poisson, la dPCR calcula la concentración absoluta tanto de HER2 como de los genes de referencia. la finalvalor CNVestá determinada por la proporción de los dos, eliminando la necesidad de estándares externos.

Figura 1: Diagrama esquemático de los principios de la PCR digital.

En este flujo de trabajo (Figura 2), unensayo dPCR dúplexutiliza dos tintes fluorescentes para evaluarHER2y el gen de referenciaFEI5(se sabe que tiene dos copias).

Como se muestra en la Figura 3, las particiones dPCR contienen HER2 (azul), EIF5 (verde) o ambos (rojo). Mediante la distribución de Poisson, el software determina las concentraciones absolutas. En este ejemplo, el número de copias de HER2 de la muestra se calculó en aproximadamente2.92, capturando ganancias sutiles que los métodos tradicionales podrían pasar por alto.

Figura 2: Proceso simplificado de dPCR (ensayo dúplex) multiobjetivo. Figura 3: Diagrama de dispersión 2D para el cálculo de CNV.

Figura 3: Diagrama de dispersión 2D para el cálculo de CNV.

La PCR digital es una tecnología de vanguardia basada en la amplificación de una sola molécula. Las soluciones dPCR de JLM-Lifetech ofrecen:

• Verdadera cuantificación absoluta:Obtenga copias directas/μL sin curvas estándar.
• Sensibilidad ultraalta:Ideal para detectar mutaciones raras y biopsias líquidas (ctDNA) donde las secuencias diana son extremadamente escasas.
• Alta tolerancia:La partición minimiza los efectos de los inhibidores de la PCR, lo que garantiza la confiabilidad en muestras biológicas complejas.
• Sesgo minimizado:La eliminación de la competencia entre las moléculas objetivo garantiza resultados auténticos y reproducibles.

Aplicaciones de JLM-Lifetech dPCR:

• Detección de secuencia rara (biopsia líquida)
• Análisis de variación del número de copias (CNV)
• Detección de patógenos y monitoreo de carga viral
• Cuantificación de la biblioteca NGS
• Detección de trazas de contaminantes