Анализ вариации числа копий (CNV) имеет важное значение для понимания генетического разнообразия и механизмов заболевания.Анализ микромассивов, и Next-Generation Sequencing (NGS) широко используются, каждый из них имеет свои ограничения:

• Ограниченная количественная оценка:FISH и Flow Cytometry предлагают ограниченные количественные данные по сравнению сЦифровая ПЦР (dPCR), часто отсутствуют тонкие микро-вариации.
• Сложность и стоимость:NGS включает в себя сложные рабочие процессы и высокие затраты, и часто препятствуется тандемным повторениям, что является отличительной чертой многих CNV.
• Пороги чувствительности: Методы, основанные на qPCR, хотя и эффективны, опираются на стандартные кривые и обычно обнаруживают только вариации, превышающие в 2 раза.

Напротив,dPCRпозволяет истинныйабсолютная количественная оценкабез необходимости использования стандартных кривых, обеспечивающих достаточно высокую чувствительность для обнаружения вариаций до 10%.

Высокая чувствительность имеет решающее значение для клинического понимания, особенно вАмплификация гена HER2 (ERBB2)Находясь на хромосоме 17, HER2 действует как "клеточный ускоритель". Аномальное усиление приводит к чрезмерной экспрессии белка HER2, что приводит к агрессивному росту опухоли, более высоким показателям рецидива,и более плохой прогноз.

При раке молочной железы, вызванном соматическими мутациями, более 20% случаев проявляют дополнительные копии HER2.который маскирует сигнал CNVВот гдевысокая чувствительность dPCRстановится необходимым для точной оценки.

1. Бесконечное разведение и разделение:Образцы ДНК, содержащие цель (HER2) и эталонные гены, сильно разбавляются и распределяются по тысячам независимых микро-единиц (капель или нановолнов).каждая единица содержит либо одну, либо нуль целевых молекул.Это изолирует редкие объекты от фонового шума и смягчает воздействие ингибиторов ПЦР.
2. Параллельная амплификация ПЦР:Усиление ПЦР происходит одновременно во всех независимых единицах.
3. Прямая подсчет и статистика Пойсона:Подсчитывая положительные разделы и применяяМодели распределения рыбы, dPCR рассчитывает абсолютную концентрацию как гена HER2, так и референтного гена.Значение CNVопределяется соотношением этих двух, исключая необходимость в внешних стандартах.

Рисунок 1: Схематическая схема принципов цифровой ПЦР.

В этом рабочем процессе (рисунок 2)двойной анализ dPCRиспользует два флуоресцентных красителя для оценкиHER2и эталонный генЕИФ5(известно, что есть два экземпляра).

Как показано на рисунке 3, разделы dPCR содержат либо HER2 (синий), EIF5 (зеленый), либо оба (красный).количество копий HER2 в образце было рассчитано приблизительно2.92, захватывая тонкие выгоды, которые традиционные методы могут упускать из виду.

Рисунок 2: Процесс упрощенной многоцелевой дПЦР (двойной анализ). Рисунок 3: 2-мерный график рассеивания для расчета CNV.

Рисунок 3: 2-мерный график рассеивания для расчета CNV.

Цифровая ПЦР - это передовая технология, основанная на амплификации одной молекулы.

• Истинное абсолютное количественное определение:Получить прямые копии/μL без стандартных кривых.
• Ультравысокая чувствительность:Идеально подходит для обнаружения редких мутаций и жидких биопсий (ctDNA), где целевые последовательности крайне редки.
• Высокая толерантность:Разделение минимизирует воздействие ингибиторов ПЦР, обеспечивая надежность в сложных биологических образцах.
• Минимизированные предубеждения:Устранение конкуренции между целевыми молекулами обеспечивает подлинные и воспроизводимые результаты.

Применение JLM-Lifetech dPCR:

• Выявление редких последовательностей (жидкая биопсия)
• Анализ изменения количества копий (CNV)
• Выявление патогенов и мониторинг вирусной нагрузки
• Квантификация библиотеки NGS
• Выявление следов загрязняющих веществ