Патогенные микроорганизмы, гены антибиотикорезистентности (ГАР) и экзогенные патогенные нуклеиновые кислоты скрываются в городских бытовых сточных водах, больничных сточных водах, промышленных стоках и сетях водосбора. Эти «невидимые риски» составляют основные проблемы безопасности водной среды и профилактики и контроля общественного здравоохранения.

Рисунок 1: Судьба и потенциальные пути воздействия инфекционных вирусов в городском водном цикле Источник: Wigginton K.R., et al. Emerging Investigators Series: The source and fate of pandemic viruses in the urban water cycle. 2015. (Перевод)

Как мы можем точно «выловить» эти невидимые риски из сложных матриц сточных вод? Ответ кроется в цифровой ПЦР.

Тестирование сточных вод по своей сути сложно.

Во-первых, целевые нуклеиновые кислоты обычно присутствуют в чрезвычайно низких концентрациях. В экологических образцах вирусы, патогенные бактерии или специфические функциональные гены могут присутствовать в ничтожных количествах. Особенно на ранних стадиях вспышек заболеваний или начального загрязнения концентрации целевых молекул часто падают значительно ниже стабильного предела обнаружения традиционных методов.

Во-вторых, матрицы образцов сточных вод очень сложны. Сточные воды из разных источников могут содержать гуминовые кислоты, полисахариды, белки и другие ингибиторы ПЦР, которые снижают эффективность амплификации, приводя к предвзятым результатам тестирования.

В то время как количественная ПЦР в реальном времени (qPCR) полагается на стандартные кривые для абсолютной количественной оценки, цифровая ПЦР (dPCR) разделяет реакционную смесь на десятки тысяч независимых микрореакций. Путем расчета соотношения положительных и отрицательных реакций с использованием статистики Пуассона, dPCR достигает абсолютной количественной оценки целевых молекул нуклеиновых кислот без стандартных кривых.

Типичные применения цифровой ПЦР в тестировании сточных вод

• Мониторинг патогенов и раннее предупреждение об эпидемиологической ситуации: Человеческие вирусные нуклеиновые кислоты, переносимые сточными водами, отражают статус инфекции в сообществе. Используя высокую чувствительность к низкоконцентрированным мишеням, dPCR контролирует вирусные нуклеиновые кислоты для предоставления данных для предупреждений о рисках для общественного здравоохранения. Например, во время вирусных эпидемий обнаружение фрагментов вирусных нуклеиновых кислот в сточных водах помогает оценить тенденции распространения в сообществе, смещая стратегию от «пассивного тестирования» к «проактивному предупреждению».

• Обнаружение генов антибиотикорезистентности (ГАР): Антибиотикорезистентность является критической проблемой общественного здравоохранения во всем мире. Являясь ключевой средой для передачи микроорганизмов и обмена генами, сточные воды содержат разнообразные гены резистентности. Цифровая ПЦР позволяет точно количественно определять низкоконцентрированные ГАР, предоставляя надежные данные для оценки очистки сточных вод и анализа экологических рисков резистентности.

• Оценка микробного загрязнения и качества воды: Традиционные методы культивирования трудоемки и не могут охватить некультивируемые микроорганизмы. dPCR на основе нуклеиновых кислот напрямую анализирует генетические маркеры целевых микроорганизмов для повышения эффективности, что делает ее хорошо подходящей для мониторинга очистных сооружений, промышленных сточных вод и экологических водоемов.

Для решения таких задач, как низкоконцентрированные мишени, сложные матрицы и высокие требования к точности, JLM-Lifetech предлагает высокочувствительные, высокостабильные и высокоэффективные решения для dPCR для экологического молекулярного тестирования с использованием интегрированной однокристальной микрофлюидной технологии.

Основная технология: однокристальный интегрированный микрофлюидный чип

Рисунок 2: Однокристальный интегрированный микрофлюидный чип

Цифровая ПЦР-система JLM-Lifetech использует инновационную интегрированную конструкцию микрофлюидного чипа, сочетающую преимущества капельной и чиповой dPCR. Интегрируя генерацию капель, амплификацию ПЦР и флуоресцентное детектирование на одной платформе, она обеспечивает замкнутый рабочий процесс «образец на входе, результат на выходе».

После загрузки образцы приводятся в движение микрофлюидной системой для генерации плотного, однородного однослойного слоя матричных микрокапель. Амплификация ПЦР происходит непосредственно на чипе без операций переноса капель, что исключает потери образца и перекрестное загрязнение у источника. Точный контроль температуры обеспечивает быструю термическую циклизацию, значительно сокращая время амплификации.

При сложном тестировании сточных вод эта технология гарантирует надежное обнаружение низкоконцентрированных мишеней благодаря однородности капель, точному контролю температуры и предотвращению загрязнения.

Дополнительные преимущества цифровой ПЦР-системы JLM-Lifetech:

• Чувствительность на уровне одной копии: Достигает предела обнаружения до уровня одной копии, эффективно преодолевая низкую концентрацию мишеней и сложное фоновое вмешательство в образцах сточных вод.

• Расширенные возможности мультиплексирования: Превосходит ограничения аппаратных каналов для количественной оценки большего количества мишеней в одной реакции, экономя образцы и реагенты, а также сокращая время выполнения работ.

Рисунок 3: Используя метод зондов TaqMan с каналами FAM, HEX, ROX и Cy5 (с конфигурацией 2, 2, 3 и 2 зондами соответственно), установлена 9-плексная dPCR система. 2D-графики по шести комбинациям каналов демонстрируют четкое разрешение положительных капель для каждой мишени.

• Интеллектуальный анализ изображений: Поддерживает визуальную обратную трассировку положительных капель для идентификации и исправления потенциальных ложноположительных результатов, повышая специфичность и точность.

• Открытая платформа: Совместима со сторонними реагентами, снижая эксплуатационные расходы.

DiOne: Полностью автоматизированная однокристальная система

• Пропускная способность: 4–32 образца/партия

• Оптические каналы: 4/5/6/7 каналов

• Генерация капель: 20 000–25 000 капель

Цифровая матрица: Генератор микрокапельной матрицы и термоциклер + Ридер микрокапельной матрицы

• Генератор и термоциклер: 1–32 образца/партия, 20 000–30 000 капель

• Ридер: 3/4/5 каналов, 1–16 образцов/партия

От мониторинга экологических рисков до ранних предупреждений общественного здравоохранения, от обнаружения патогенов до профилирования генов резистентности, наблюдение за сточными водами вступает в более точную и эффективную молекулярную эру. Цифровая ПЦР-система JLM-Lifetech предоставляет высокочувствительные, высокоточные и автоматизированные возможности молекулярного тестирования для экологического мониторинга, расширяя возможности ЦКПЗ, агентств по охране окружающей среды, научно-исследовательских институтов, испытательных лабораторий и экологических секторов.