Microrganismi patogeni, geni di resistenza agli antibiotici (ARG) e acidi nucleici patogeni esogeni si annidano nelle acque reflue domestiche urbane, nelle acque reflue ospedaliere, negli effluenti industriali e nelle reti fluviali. Questi "rischi invisibili" costituiscono i problemi centrali della sicurezza dell'ambiente idrico e della prevenzione e controllo della salute pubblica.

Figura 1: Il destino e i potenziali percorsi di esposizione dei virus infettivi nel ciclo idrico urbano Fonte: Wigginton K.R., et al. Emerging Investigators Series: The source and fate of pandemic viruses in the urban water cycle. 2015. (Tradotto)

Come possiamo "pescare" accuratamente questi rischi invisibili da matrici complesse di acque reflue? La risposta risiede nella PCR digitale.

Il test delle acque reflue è intrinsecamente complesso.

In primo luogo, gli acidi nucleici bersaglio sono solitamente presenti in concentrazioni estremamente basse. Nei campioni ambientali, virus, batteri patogeni o geni funzionali specifici possono esistere in quantità minime. Soprattutto nelle prime fasi di epidemie o contaminazioni iniziali, le concentrazioni delle molecole bersaglio spesso scendono ben al di sotto del limite di rilevamento stabile dei metodi tradizionali.

In secondo luogo, le matrici dei campioni di acque reflue sono altamente complesse. Le acque reflue provenienti da diverse fonti possono contenere acidi umici, polisaccaridi, proteine e altri inibitori della PCR che riducono l'efficienza di amplificazione, portando a risultati di test distorti.

Mentre la PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) si basa su curve standard per la quantificazione assoluta, la PCR digitale (dPCR) suddivide la miscela di reazione in decine di migliaia di micro-reazioni indipendenti. Calcolando il rapporto tra reazioni positive e negative utilizzando la statistica di Poisson, la dPCR ottiene la quantificazione assoluta delle molecole di acido nucleico bersaglio senza curve standard.

Applicazioni tipiche della PCR digitale nei test delle acque reflue

• Monitoraggio dei patogeni e allerta precoce epidemiologica: Gli acidi nucleici virali umani trasportati nelle acque reflue riflettono lo stato di infezione della comunità. Sfruttando l'alta sensibilità per i bersagli a bassa abbondanza, la dPCR monitora gli acidi nucleici virali per fornire supporto dati per avvisi di rischio per la salute pubblica. Ad esempio, durante le epidemie virali, il rilevamento di frammenti di acido nucleico specifici del virus nelle acque reflue aiuta a valutare le tendenze di trasmissione comunitaria, spostando la strategia da "test passivo" a "allerta proattiva".

• Rilevamento di geni di resistenza agli antibiotici (ARG): La resistenza agli antibiotici è una preoccupazione critica per la salute pubblica globale. Essendo un mezzo ambientale chiave per la trasmissione microbica e lo scambio di geni, le acque reflue ospitano diversi geni di resistenza. La PCR digitale consente la quantificazione accurata di ARG a bassa abbondanza, fornendo dati affidabili per la valutazione del trattamento delle acque reflue e l'analisi del rischio di resistenza ambientale.

• Contaminazione microbica e valutazione della qualità dell'acqua: I metodi di coltura tradizionali richiedono tempo e non possono coprire microrganismi non coltivabili. La dPCR basata su acidi nucleici analizza direttamente i marcatori genetici dei microrganismi bersaglio per aumentare l'efficienza, rendendola adatta al monitoraggio di impianti di trattamento delle acque reflue, acque reflue industriali e corpi idrici ecologici.

Per affrontare sfide come bersagli a bassa concentrazione, matrici complesse e requisiti di alta precisione, JLM-Lifetech fornisce soluzioni dPCR ad alta sensibilità, alta stabilità e alta efficienza per test molecolari ambientali utilizzando una tecnologia di chip microfluidico integrato all-in-one.

Tecnologia di base: Chip microfluidico integrato all-in-one

Figura 2: Chip microfluidico integrato all-in-one

Il sistema PCR digitale JLM-Lifetech utilizza un innovativo design di chip microfluidico integrato, combinando i vantaggi della dPCR basata su gocce e su chip. Integrando la generazione di gocce, l'amplificazione PCR e il rilevamento di fluorescenza su un'unica piattaforma, ottiene un flusso di lavoro chiuso "campione in ingresso, risultato in uscita".

Una volta caricati, i campioni vengono guidati dal sistema microfluidico per generare uno strato denso e uniforme di microgocce di matrice. L'amplificazione PCR avviene direttamente sul chip senza operazioni di trasferimento delle gocce, eliminando la perdita di campioni e la contaminazione incrociata alla fonte. Il controllo preciso della temperatura consente un rapido ciclo termico, riducendo significativamente il tempo di amplificazione.

Nei test complessi delle acque reflue, questa tecnologia garantisce il rilevamento affidabile di bersagli a bassa abbondanza attraverso l'uniformità delle gocce, il controllo preciso della temperatura e la prevenzione della contaminazione.

Vantaggi aggiuntivi del sistema PCR digitale JLM-Lifetech:

• Sensibilità a singola copia: Raggiunge un limite di rilevamento fino al livello di singola copia, superando efficacemente la bassa abbondanza di bersagli e la complessa interferenza di fondo nei campioni di acque reflue.

• Capacità avanzata di multiplexing: Si espande oltre i limiti dei canali hardware per quantificare più bersagli in una singola reazione, risparmiando campioni e reagenti e riducendo i tempi di risposta.

Figura 3: Utilizzando il metodo della sonda TaqMan con canali FAM, HEX, ROX e Cy5 (configurati rispettivamente con 2, 2, 3 e 2 sonde), viene stabilito un sistema dPCR 9-plex. I grafici 2D attraverso sei combinazioni di canali dimostrano una chiara risoluzione delle gocce positive per ciascun bersaglio.

• Analisi intelligente delle immagini: Supporta il tracciamento visivo delle gocce positive per identificare e correggere potenziali falsi positivi, migliorando la specificità e la precisione.

• Piattaforma aperta: Compatibile con reagenti di terze parti, riducendo i costi operativi.

DiOne: Sistema all-in-one completamente automatizzato

• Throughput: 4–32 campioni/lotto

• Canali ottici: 4/5/6/7 canali

• Generazione di gocce: 20.000–25.000 gocce

Matrice digitale: Generatore di matrice di microgocce e termociclatore + Lettore di matrice di microgocce

• Generatore e termociclatore: 1–32 campioni/lotto, 20.000–30.000 gocce

• Lettore: 3/4/5 canali, 1–16 campioni/lotto

Dal monitoraggio del rischio ambientale agli allarmi precoci per la salute pubblica, dal rilevamento dei patogeni al profilo dei geni di resistenza, la sorveglianza delle acque reflue sta entrando in un'era molecolare più precisa ed efficiente. Il sistema PCR digitale JLM-Lifetech porta capacità di test molecolari ad alta sensibilità, alta precisione e automatizzate al monitoraggio ambientale, potenziando CDC, agenzie di protezione ambientale, istituti di ricerca, laboratori di analisi e settori ambientali.