为何选择数字PCR进行拷贝数变异分析？

目前已有多种拷贝数变异（CNV）分析的传统方法，包括荧光原位杂交（FISH）、流式细胞术、微阵列分析以及新一代测序（NGS）。然而这些方法均存在相应局限：例如FISH和流式细胞术相比dPCR提供的可量化结果有限，可能导致微小的拷贝数变异被遗漏；NGS分析则因工作流程复杂、成本高昂且易受串联重复序列（许多CNV的典型特征）干扰而受限。基于qPCR的方法同样是检测CNV的有效工具，但这类方法需通过标准曲线进行计算，且检测灵敏度通常仅能识别约2倍以上的差异。相比之下，dPCR无需标准曲线即可实现真实的绝对定量分析，灵敏度足以检测低至10%的差异。

这种高灵敏度对疾病认知至关重要，以乳腺癌HER2基因扩增为例：HER2基因（人类表皮生长因子受体2基因，也称ERBB2）是一种帮助控制细胞生长的基因，位于第17号染色体上。当HER2基因出现异常（即“扩增”）时，它会在癌细胞表面产生过多的HER2蛋白（即“过表达”），这就像给癌细胞装上了过多的“加速器”，导致癌细胞生长更快、更具侵袭性，并与更高的复发风险和较差的预后相关。在由体细胞突变引发的乳腺癌中，超过20%（可能更高比例）的病例存在该基因的额外拷贝。无论在科研或诊断领域进行CNV检测，肿瘤活检样本面临的共同挑战是样本中常混杂大量正常细胞。这种情况会显著增加癌细胞HER2拷贝数变异精准评估的难度——同时这也凸显出dPCR高灵敏度检测技术的应用价值。

1. 无限稀释与分区：将含有待测HER2基因和参考基因的DNA样本，充分稀释后，分配到成千上万个微小的、独立的微反应单元（如微滴或微孔）中。理想状态下，每个单元要么包含一个拷贝的目标DNA分子，要么没有。这一步骤将稀有的目标分子从潜在的背景“噪声”中分离出来，使其更容易被检测，同时稀释潜在的PCR抑制剂，可降低抑制剂的干扰
2. 并行PCR扩增：在所有独立的单元里同时进行PCR扩增。反应结束后，有目标DNA分子的单元会发出荧光（阳性），没有的则不发光（阴性）。
3. 直接计数与计算：通过读取阳性单元的数量，利用泊松分布概率模型，不需要任何标准曲线，就能直接反推出样本中HER2基因和参考基因的绝对初始拷贝数。最后，直接计算两者拷贝数的比值，就能得到精确的CNV值。

图1：数字PCR检测原理示意图。

在本示例中（图2），进行了一项两重dPCR反应，使用两种不同颜色的荧光染料（分别显示为蓝色和绿色）评估两个不同的基因（HER2和EIF5）。其中，EIF5作为参照基因，已知是两个拷贝。如图3所示，部分dPCR分区仅含有HER2（蓝色），部分仅含有EIF5（绿色），而部分分区两者兼有（显示为红色）；随后通过泊松分布计算评估样本中存在的实际拷贝数浓度。本示例显示，该样本中HER2基因的拷贝数约为2.92个。

图2：基于探针的dPCR简化示意图。图中展示了同时检测两个靶标（HER2和EIF5）的过程（多重dPCR）。

图3：使用双重Assay计算拷贝数的示例。在二维散点图（上图）中，每个点代表一个检查事件（即微反应单元）。分析软件自动计算每种信号的绝对事件数量，然后通过泊松分布计算确定样本中存在的拷贝数。最后，通过目标/参照基因的比值（下图）来确定最终的拷贝数。

总之，dPCR属于一种高度灵敏的检测方法，其凭借单分子水平的灵敏度和绝对定量的能力，能够从“噪音”中分辨出微小差异，精准捕捉到肿瘤细胞中的拷贝数增加。它可以提供一个比其他工作流程更灵敏、更快、更可靠且更简单的解决方案。

• 绝对定量

  无需标准曲线，直接获得目标核酸的绝对拷贝数。

• 超高灵敏度

  能够精准检测稀有突变、低频序列等传统qPCR难以发现的靶标，尤其擅长稀有序列检测和液体活检等应用。

• 精确定量与高耐受性

  基于泊松统计的定量原理，结果更精确;样本分割技术还能有效降低PCR抑制物的干扰，对复杂样本兼容性更好。

• 减少扩增偏差

  通过将反应分割为数万个独立单元，从根本上避免了靶标分子间的竞争，使定量结果更真实，可靠。

数字PCR特别适用于需要检测少量核酸或对目标含量进行更精细区分的应用，包括:稀有序列检测(如液体活检)、拷贝数变异(CNV)分析、病原体检测、NGS文库定量、痕量污染物检测。